利用海马神经元培养检测人血清中自身抗体的实验方法

摘要

来源：Cunquero, M.，等。利用海马神经元培养检测并研究与自身免疫性脑炎相关的新致病性抗体。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了一种利用大鼠海马神经元培养物来鉴定样本中针对特定抗原的抗体的技术。通过将培养的神经元暴露于含有靶向N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）自身抗体的患者样本中，可通过免疫染色揭示结合在神经元表面的自身抗体的存在。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

第一部分：分离的胎鼠海马神经元培养物的建立

1. 准备步骤

1. 培养表面的多聚-L-赖氨酸（PLL）包被（解剖前3天）
   1. 通过将2.38 g硼酸和1.27 g硼砂加入500 mL蒸馏水中，搅拌15分钟至完全溶解，制备硼酸盐缓冲液。在通风橱中，用滤膜（0.2 µm孔径）过滤缓冲液以灭菌，贴标签后室温（RT）保存。
      注意：该溶液稳定，可使用6个月。
      ​注意：配制硼酸盐缓冲液时，请穿戴推荐的个人防护装备。
   2. 通过将1 g PLL溶于10 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，制备PLL储存液（100 mg/mL）。将PLL储存液分装为500 µL每份。为获得终浓度1 mg/mL的溶液，取500 µL PLL分装液加入50 mL硼酸盐缓冲液中，轻轻旋转混匀至溶解，并通过过滤（0.2 µm孔径）灭菌。
      注意：该溶液稳定，可使用6个月。
   3. 准备用于包被的表面。免疫染色实验使用直径12 mm的盖玻片，活神经元成像研究使用玻璃底培养皿。若使用盖玻片，需先高压灭菌，然后将五片盖玻片放入每个培养皿（直径3.5 cm）中。
      注意：盖玻片的厚度会影响所获取图像的信号质量和强度。大多数显微镜物镜设计适用于#1.5规格的盖玻片。请根据成像设备和实验技术选择合适的盖玻片。
   4. 在通风橱中，向每个培养皿（玻璃底培养皿或含五片盖玻片的3.5 cm培养皿）中加入1.5 mL PLL溶液。确保所有盖玻片均被浸没，并于室温下孵育24小时。
   5. 解剖前2天，吸除PLL溶液，用无菌无内毒素水清洗，确保盖玻片完全浸没。在培养皿中保留水，并于室温下继续存放24小时。
   6. 解剖前1天，吸除水，更换为NB + B27培养基（见下文），并将培养皿置于37 °C培养箱中孵育24小时。
2. 培养基与储存液的配制（解剖前1天）
   1. 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）：向500 mL不含L-谷氨酰胺和酚红的高糖DMEM（4.5 g/L）中，加入50 mL马血清、50 mL胎牛血清（FBS）、10 mL L-谷氨酰胺（200 mM）、10 mL丙酮酸钠（100 mM）和10 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）。过滤（0.2 µm孔径）后，分装为5 mL每份，盖紧瓶盖，4 ᵒC保存。
      注意：该溶液稳定，可使用1个月。
   2. 添加B27的Neurobasal培养基（NB + B27）：向50 mL不含酚红的Neurobasal培养基中加入1 mL B27补充剂。
   3. 添加B27的Hibernate-E培养基（Hibernate + B27）：向50 mL Hibernate-E培养基中加入1 mL B27补充剂。
   4. 细胞外生理溶液（EPS）：向1 L无菌水中加入以下成分至指定终浓度：NaCl（140 mM）、KCl（3.5 mM）、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)（HEPES，10 mM）、葡萄糖（20 mM）和CaCl₂（2 mM）。搅拌至完全溶解，用NaOH（0.5 M）或HCl（0.5 M）调节pH至7.4。在通风橱中过滤灭菌（0.2 µm孔径），4°C保存。
3. 仪器及其他实验材料准备（解剖当天）
   1. 将水浴锅预热至37 °C。加热以下分装液：50 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）和5 mL DMEM。
   2. 将以下器械浸入盛有无水乙醇的烧杯中进行灭菌（图1B）：镊子、弯头镊、剪刀、精细弯头镊、精细直头镊、手术剪、精细角状镊和精密弹簧剪。
      注意：为保护器械，在烧杯底部放置柔软材料（如科学级精密擦拭纸）。
   3. 准备两个冰盘，并放置以下物品。
      1. 冰盘1（图1C）：在盛有无水乙醇的烧杯中放置手术器械，另备一个盛有HBSS的烧杯用于冲洗手术器械，一个10 cm培养皿盛HBSS用于放置胚胎，一个6 cm培养皿盛HBSS用于放置胚胎头部，以及一个6 cm培养皿盛Hibernate + B27用于放置胚胎脑组织。
      2. 冰盘2：放置1 mL 2.5%胰蛋白酶分装液，以及一个盛有Hibernate + B27的3.5 cm培养皿，用于存放分离的海马体。
         注意：该操作所需时间取决于操作者的经验及待解剖胚胎数量。因此，冰块必须维持足够长时间的冻结状态。建议使用聚苯乙烯材质的冰盘。

2. 解剖与接种（图1）

1. 海马体分离
   注意：根据巴塞罗那大学当地伦理委员会的规定，并遵循欧洲关于实验动物使用与护理的法规（2010/63/UE），在本方案开始前立即对妊娠至胚胎第18天（E18）的大鼠实施安乐死。本方案中采用二氧化碳（CO₂）吸入法作为安乐死方式。
   1. 使用镊子和剪刀在腹部腹膜水平处解剖大鼠，取出带有E18胚胎的子宫，并将其置于一个预先在冰上冷却的10 cm培养皿中。
      ​注意：应避免大鼠毛发附着于胚胎上。建议使用大量70%乙醇对腹部进行消毒。从本步骤起，所有操作均需在冰盒1上的超净台内进行。
   2. 打开胚胎囊，将胚胎转移至含有HBSS的10 cm培养皿中，确保胚胎完全浸没在液体中。
   3. 用剪刀剪下胚胎头部，并将其放入含有HBSS的6 cm培养皿中。对所有胚胎重复此操作。
      注意：为避免污染，除胚胎头部外的所有组织均应丢弃至带螺旋盖的容器中。
   4. 用精细弯头镊夹住胚胎头部，用精细直头镊以45°角刺入眼眶，随后松开弯头镊。
      注意：直头镊不可穿透脑组织，因此进入时必须保持角度准确。
   5. 使用手术剪从枕骨向额骨方向剪开皮肤和颅骨。用精细弯头镊取出脑组织，并将其放入含有Hibernate + B27的6 cm培养皿中。重复此操作直至所有脑组织均被取出。
   6. 使用精细直头镊将端脑沿矢状面分离。
      注意：从本步骤起，海马体的解剖操作应在体视显微镜下进行。建议使用可调节光源的灯具，使光线从两侧照射解剖面。同时建议使用黑色背景，以提高对比度，更清晰地辨识海马体。
   7. 准备一个10 cm培养皿，在其中以约1 cm间隔滴加Hibernate + B27（例如呈环形排列）。每个Hibernate + B27液滴中放置一个端脑，并通过解剖显微镜观察（推荐使用1.25倍物镜放大倍数）。
   8. 小心剥离脑膜并去除丘脑，以便更清楚地观察海马体。
   9. 使用精密弹簧剪解剖海马体，并将其放入冰盒2中盛有Hibernate + B27的3.5 cm培养皿中。对每个端脑重复此操作，直至收集完所有海马体。
   10. 用巴斯德移液管小心收集所有海马体，并转移至50 mL离心管中。
       注意：收集海马体时应尽量减少Hibernate + B27的体积，以免稀释胰蛋白酶。
2. 细胞解离
   1. 海马体的酶解解离
      1. 在含有海马体的50 mL离心管中加入1 mL 2.5%胰蛋白酶，并用HBSS补足至5 mL体积。在37 °C水浴中孵育15分钟。
      2. 为稀释胰蛋白酶，加入10 mL预热的HBSS，并在37 °C水浴中孵育5分钟。
      3. 使用1,000 µL移液器将此时呈黏液状的海马体转移至另一50 mL离心管中，加入6 mL预热的HBSS，并在37 °C水浴中孵育5分钟。
   2. 海马体的机械解离
      1. 将组织块转移至锥底2 mL离心管中，尽量减少液体体积。加入1 mL预热的DMEM培养基。用1,000 µL移液器轻轻反复吹打，使沉淀均匀悬浮。
         注意：吹打过程中必须避免产生气泡，因为气泡可能导致细胞破裂。
      2. 使用预先拉制的玻璃移液管重复吹打10–20次，移液管尖端应接触管底锥形部分。避免产生气泡。此步骤结束时，混合液应呈半透明状。
      3. 当混合液均匀且呈半透明时，将其转移至含有4 mL 37 °C DMEM培养基的离心管中，并用玻璃移液管上下吹打混匀。
3. 细胞接种
   1. 对细胞进行计数。溶液中神经元的数量可根据标准实验室流程进行测定。
      注意：在用于抗体检测和钙活性成像的实验中，每3.5 cm培养皿接种50,000个细胞为最佳浓度。
   2. 保持细胞悬浮状态，吸取计算好的体积，接种于含有PLL包被盖玻片的3.5 cm培养皿或PLL包被的玻璃底培养皿中。
   3. 通过交叉方向的轻柔振荡（前后、再左右，必要时重复）使细胞在培养皿中均匀分布，并将培养皿置于含5% CO₂的培养箱中。
      注意：使用交叉振荡方式非常重要，可防止细胞在培养皿边缘聚集。
   4. 每周添加约1 mL NB + B27，以防止培养液干燥。
      注意：体外培养2周（14天 in vitro [div]）后，神经元已成熟，表达所有可用于实验的因子。采用本方案每只妊娠大鼠（平均取自12个E18胚胎）可获得的神经元总数约为2.5 × 10⁶个。

第2部分：利用海马神经元培养物检测神经元细胞表面蛋白中的抗体

注意： 本实验方案部分展示了如何利用海马神经元培养物来检测抗NMDAR脑炎患者血清和/或脑脊液中的抗NMDAR抗体。通过荧光免疫染色法可观察活神经元中的抗体反应性，但也可采用其他可视化方法。本实验的适当对照应为健康个体的血清或脑脊液。使用人源样本时，需注意可能需要获得机构伦理委员会的批准。

3. 活细胞荧光免疫染色

1. 使用在盖玻片上培养的14个div细胞（每个3.5 cm培养皿中含五个盖玻片，接种密度为每皿50,000个细胞）。
2. 在生物安全柜内，用预热至37 °C的NB培养基清洗盖玻片。
3. 加入样本，本实验中为抗NMDAR抗体（作为一抗使用），用NB培养基按血清1:200或脑脊液1:2的比例稀释，于37 °C孵育1小时（置于含5% CO₂的培养箱中）。
4. 在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗3次，每次5分钟。
5. 加入固定液（PBS中含4%甲醛），室温孵育5分钟。
   注意：操作4%甲醛时，应在生物安全柜内进行，并佩戴推荐的个人防护装备。
6. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
7. 加入二抗山羊抗人IgG-AF488，按1:1000稀释，室温避光孵育1小时。
   注意：孵育过程中需用铝箔包裹以避免光照。
8. 用PBS洗涤3次，每次5分钟。随后用去离子水冲洗。
9. 用液体封片剂（例如含DAPI的抗荧光淬灭封片剂；约7 µL）封片，吸去多余液体，并用去离子水冲洗。神经元现可进行荧光成像。
   注意：操作封片剂时，应佩戴推荐的个人防护装备。

结果

图1：海马神经元原代培养的可视化操作流程。（A）流程图，展示从E18胚胎大鼠制备海马神经元单细胞悬液培养的三个步骤：1. 海马组织分离，2. 细胞解离，3. 细胞接种。（B）推荐用于海马分离的工具示意图，按三类分组：（1- 镊子，2- 弯头镊，3- 剪刀）用于胚胎采集；（4- 细弯镊，5- 细直镊，6- 手术剪）用于脑组织取出；（7- 细角镊，8- 精密弹簧剪）用于海马分离。（C）冰盒1的示意图，显示海马分离所需培养皿及培养基：胚胎及头部置于HBSS中，脑组织置于Hibernate培养基加B27添加剂中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 细胞培养皿	Nunc	12-565-020
12 mm 圆形盖玻片	Fisher	NC9708845
20x NA 0.75 S Fluor 干式物镜	Nikon	CFI Super Fluor 20X
3.5 cm 细胞培养皿	Nunc	12-565-90
6 cm 细胞培养皿	Nunc	12-565-94
B27 添加剂	Gibco	17504-044
100 mL 烧杯	Pirex	-
硼砂	Sigma-Aldrich	B9876
硼酸	Sigma-Aldrich	B0252
弯头镊子	FST	11009-13
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	D9434
高糖 DMEM（4.5 g/L），不含 L-谷氨酰胺，不含酚红	Capricorn	DMEM-HXRXA
雌性Wistar大鼠（妊娠18天）	Janvier	-
胎牛血清（FBS）	Biowest	S181B-500
尖角镊子	FST	11251-35
细弯镊子	FST	11272-30
细直镊子	FST	11251-23
FITC滤光片组	Nikon	Standard Series
镊子	FST	11000-12
山羊抗人AF488	Invitrogen	A11013
HBSS	Capricorn	HBSS-1A
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hibernate-E 培养基	Gibco	A12476-01
马血清（HS）	Thermofisher	26050088
人抗NMDAR抗体（脑脊液）	患者样本	-
人抗NMDAR抗体（血清）	患者样本	-
ImageJ/Fiji	NIH	v1.50i
倒置荧光显微镜	Nikon	Eclipse TE2000-U
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023
聚-L-赖氨酸（PLL）	Peptide international	OKK-35056
聚苯乙烯冰盒	-	-
精密弹簧剪刀	FST	15000-08
含DAPI的ProLong Gold（抗荧光淬灭封片剂）	Molecular Probes	P36941
剪刀	FST	14068-12
丙酮酸钠	Biowest	L0642-100
体视显微镜	Zeiss	Stemi 2000
手术剪刀	FST	14081-09
2.5% 胰蛋白酶	Gibco	15090046
无菌无内毒素水	Sigma-Aldrich	W3500