一种用于测定呼吸道合胞病毒特异性中和抗体滴度的检测方法

摘要

来源：Do, L. A. H.，等，一种改进的高通量呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种用于检测抗呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗体的实验方法。将含有抗RSV中和抗体的血清与病毒预先孵育，可使病毒颗粒失活，从而减少细胞感染及空斑形成。随后对感染病毒的细胞进行固定、封闭，并使用荧光素标记的抗体进行染色，以实现空斑的可视化观察。该过程可用于确定能够中和50% RSV病毒的最高血清稀释度，此即为中和抗体滴度。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：除非另有说明，所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中进行。在进行蚀斑减少中和（PRN）试验之前，必须进行病毒滴度测定，以确定PRN试验中使用的最佳呼吸道合胞病毒（RSV）浓度。建议将病毒储备液分装成小体积，每次中和抗体（NAb）试验仅解冻一次并使用。建议同一研究中所有样本的NAb试验均使用同一批病毒储备液。在向细胞培养板中添加前，应确保培养基和磷酸盐缓冲盐水（PBS）已预热至37 °C。

1. RSV 病毒滴定

注意：根据病毒储备液的数量和重复次数，可按照图1设置检测板。每种病毒储备液应在检测板上进行三份重复梯度稀释，起始浓度最高（即1:10）。通常采用1:10的连续梯度稀释。A549细胞培养与维持以及呼吸道合胞病毒（RSV）培养操作均采用标准方法，本方案中未予详述。

1. 铺板（第1天）
   1. 将A549细胞重悬于含10%胎牛血清（FCS）和1000 IU青霉素/链霉素（pen/strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，浓度为4 × 10⁵/mL。向96孔平底无菌板每孔加入100 μL，每孔含4 × 10⁴个A549细胞。
   2. 将培养板在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜（此时细胞处于对数生长期）。
      注意：在传代23次后应使用新的A549细胞冻存管。建议在新细胞冻存管仍处于前三个传代阶段时不要开始实验。
2. 病毒感染（第2天）
   1. 病毒系列稀释的制备
      1. 将一管冷冻保存的呼吸道合胞病毒（RSV）在37 °C水浴中快速解冻至几乎完全融化，立即置于冰上。对每种待检测的RSV病毒原液准备3个重复孔，初始病毒稀释比例为1:10，每孔加入100 μL稀释后的病毒液，并至少保留一整列作为阴性对照。
         注意：图1展示了三个重复的阴性对照。
      2. 在96孔U型底无菌板的A行各孔中，分别加入100 μL 1:10稀释的病毒液（三个重复）。在B至H行各孔中每孔加入90 μL不含FCS但含1000 IU pen/strep的DMEM。
      3. 通过将10 μL液体从A行转移至B行开始进行10倍系列稀释。用移液器吹打混合5次，继续进行10倍稀释直至H行。最后弃去10 μL液体，使每孔终体积为90 μL。
         注意：每次稀释必须使用新的吸头。
   2. 将病毒接种至A549细胞
      1. 取出前一天准备好的A549细胞培养板。确保96孔板中的A549细胞单层融合度约为80%。轻轻翻转培养板，用无菌吸水纸轻压以去除培养基。
      2. 用100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤所有孔两次；每次洗涤后轻轻翻转培养板并用无菌吸水纸轻压以去除多余PBS。注意避免培养板干燥。
      3. 将病毒滴定板（图1）中的病毒稀释液转移至A549细胞板的对应孔中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。孵育1小时后，用移液器小心吸去上清液（避免交叉污染），每孔取出90 μL。
      4. 向每孔加入100 μL含1.5%低黏度羧甲基纤维素钠盐（CMC）、2% FCS及青霉素/链霉素的1× Medium 199（M199，参见材料表）。
         注意：必须预先配制并储存2× M199 + 4% FCS + 2% pen/strep 和 3% CMC溶液于4 °C，以备后续使用。使用前确保溶液已在37 °C预热。
         1. 配制2× M199溶液：将1袋M199粉末溶于500 mL蒸馏水中，加入20 mL FCS和10 mL pen/strep（配成2× M199）。使用0.22 μm滤器过滤溶液。
         2. 配制3% CMC溶液：将15 g CMC缓慢加入500 mL蒸馏水中。使用金属搅拌加热器在50 °C下溶解CMC，约需1小时。充分混匀后配成3% CMC溶液，并进行高压灭菌。
            注意：必须将CMC固体缓慢加入水中溶解；若将水加入干燥的CMC固体中，会形成难以溶解的团块。
         3. 通过将步骤1.2.2.4.2中配制的2× M199与3% CMC按1:1比例混合，配制含pen/strep的1× M199 + 1.5% CMC低黏度 + 2% FCS溶液。
      5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育3天。
3. 检测板显色与分析（第5天）
   1. 固定与显色检测板
      1. 轻轻翻转培养板以弃去含pen/strep的M199 + CMC + 2% FCS。缓慢加入200 μL固定液（80%丙酮，20% PBS，储存于-20 °C），避免扰动细胞层。在-20 °C孵育20分钟。
      2. 弃去固定液，用吸水纸轻轻吸干。将培养板倒置放置10分钟使其干燥。
         注意：从本步骤起，实验可在BSL2生物安全柜外进行。
      3. 在含0.05%聚山梨酯20的过滤PBS（PBS-聚山梨酯，参见材料表）中配制5%脱脂奶粉封闭液。根据每孔200 μL、共110孔计算单块板所需封闭液体积：200 μL/孔 × 110孔 = 22 mL（即1.1 mL浓缩奶粉稀释液加入20.9 mL过滤的PBS-聚山梨酯）。此时也应配制足够量的封闭液用于一抗和二抗的稀释。根据每孔50 μL、共110孔计算每种抗体溶液所需体积：50 μL/孔 × 110孔 = 5.5 mL。因此，单次检测板实验所需的总封闭液体积为33 mL。
      4. 每孔加入200 μL封闭液，在室温（RT）孵育30分钟。轻轻翻转培养板并用吸水纸吸干液体。
      5. 用封闭液将山羊抗RSV抗体（单克隆抗体，mAb——一抗）按1:500稀释。每孔加入50 μL一抗溶液，在37 °C孵育1小时。用过滤的PBS-聚山梨酯洗涤3次。
      6. 用封闭液将Alexa Fluor标记的驴抗山羊IgG（二抗）按1:5,000稀释。每孔加入50 μL二抗溶液，在37 °C孵育1小时。用过滤的PBS-聚山梨酯洗涤5次。
      7. 使用自动斑点计数仪，选择异硫氰酸荧光素（FITC）通道和计数设置读取培养板，如图2所示。用铝箔包裹培养板并储存于4 °C。检测前使用未使用的96孔培养板校准仪器，并输入计数参数。
         注意：如需，可在数日内重新扫描。若后续实验使用相同类型的培养板，可保存并重复使用本次校准和计数设置。
      8. 检查各孔图像是否存在伪影斑块或细胞单层破坏（图3）。排除细胞单层被破坏的孔。
         注意：根据伪影斑块的大小，可能需要对这些孔进行手动计数，或在数据分析中剔除这些孔。有效结果的判定标准包括：超过一个重复孔中未检测到细胞单层破坏或伪影斑块，且阴性对照孔（未加病毒孔）中未检测到斑块形成单位（PFU）。
   2. 确定病毒浓度
      1. 选择最后两个可清晰计数斑点的稀释度。计算同一稀释度下重复孔的平均斑点数。使用以下公式计算原液样本的病毒滴度（每毫升PFU数）：
         PFU/mL = 平均斑点数 /（稀释倍数 × 加入孔中的稀释病毒液体积）
         注意：所测定的每种RSV原液浓度现在可用于PRN实验（步骤2）。

2. RSV 中和实验

1. 铺板（第1天）
   1. 将A549细胞以DMEM + 10% FCS + 1000 IU 青霉素/链霉素重悬至浓度为4 × 10⁵/mL。在96孔平底无菌板中每孔加入100 μL，含4 × 10⁴个A549细胞，于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜（细胞将处于对数生长期）。
      注意： A549细胞传代超过23代后应使用新的冻存管。不建议在第3代之前使用A549细胞。
2. 病毒与血清制备（第2天）
   注意： 根据样本类型的不同，在进行中和抗体（NAb）检测前可能需要对样本进行预处理。建议使用目前可向英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）申请获取的呼吸道合胞病毒（RSV）国际标准血清。
   1. 血清稀释液的制备
      1. 在室温下解冻人源RSV参考抗血清（参考血清，REF）及待测血清样本。使用前将血清样本和参考抗血清置于56 °C水浴中灭活30分钟。根据板式模板（图4）进行稀释。
      2. 制备1:100稀释的REF血清。每块检测板至少准备110 μL用不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素稀释的REF血清（例如，将1.5 μL REF加入总体积为150 μL的稀释液中）。取110 μL 1:100稀释的REF加入96孔U型底无菌板的A12孔中。
      3. 向第12列的B12至H12孔中各加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素。通过从A行转移55 μL至B行，并用移液器吹打混合5次，依次进行1:2倍比稀释至H行。最后弃去55 μL培养基，使每孔终体积为55 μL。每次稀释均需使用新的吸头。
      4. 制备待测血清样本的1:100稀释液。由于所有血清样本均设三个复孔，因此每份待测血清样本至少需准备110 μL/孔 × 3 = 330 μL的稀释液。
      5. 将每份稀释后的待测血清样本（1:100稀释；S1 = 血清1，S2 = 血清2，依此类推）各取110 μL，按照图4所示加入96孔无菌板中对应的A1至A9孔以及E1至E9孔。
      6. 向所有标记为X的孔中加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素。参照步骤2.2.1.3的方法进行1:2倍比稀释至D行（适用于样本1、2和3）。最后弃去55 μL培养基，使每孔终体积为55 μL。同样地，对样本4、5和6在E至H行进行1:2倍比稀释。
         注意： 每次稀释必须使用新的吸头。
      7. 向第10列和第11列各孔中加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素。
   2. 病毒制备​
      1. 将一支冻存的RSV病毒管迅速置于37 °C水浴中快速解冻至几乎完全融化，立即转移至冰上。
      2. 根据步骤1.3.2测定的RSV分装浓度，用不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素稀释病毒。调整稀释度使每孔接种量约为200 PFU。共准备5.5 mL总体积（用于100个孔）。
   3. 病毒-血清混合液的制备
      1. 根据板式模板（图4），向第1–9列的所有孔以及第10和第11列的E–H行孔（阳性对照）中各加入55 μL稀释后的病毒液。
      2. 向第10和第11列的A–D行各孔（阴性对照）中加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素。将板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
   4. 将病毒接种至A549细胞
      1. 在孵育结束前，取出步骤2.1.1中准备的A549细胞板。确保96孔板中的A549细胞单层融合度约为80%。
      2. 轻轻翻转板子，用无菌吸水纸轻拍以弃去培养基。每孔用100 μL PBS洗涤两次，每次洗涤后同样轻拍去除多余PBS。注意避免板子干燥。
      3. 根据板式模板，将100 μL/孔的病毒-血清混合液转移至对应的A549细胞板孔中。于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
      4. 1小时后，用移液器从每孔中吸出90 μL，并加入100 μL预热至37 °C的1× M199培养基 + 1.5% CMC + 2% FCS + 青霉素/链霉素。将板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育3天。
         注意： 加入板前务必确保溶液已预热至37 °C。
3. 检测板显色与数据分析（第5天）​
   1. 按照步骤1.3.1.1至1.3.1.8进行固定及检测板显色处理。
   2. 确定50%中和滴度
      1. 通过计算“无血清”对照孔（即阳性病毒对照——第10列E–H行）的50%抑制率上下两个倒数血清稀释度之间的比例距离，确定50%中和滴度。
      2. 计数血清孔和无血清对照孔中由单个病毒感染形成的PFU（即空斑）数量。计算无血清对照孔PFU数的平均值，并确定其50%的数值。
      3. 找出PFU计数最接近且分别高于和低于该50%值的血清稀释度。使用半对数坐标图或电子表格模板，以PFU数量为x轴（线性刻度），以血清稀释倍数的倒数为y轴（log₁₀刻度）作图。连接这两个点画一条直线，由此直线读取待测血清样本的50%中和滴度。

结果

图1：用于定量RSV病毒储备液的病毒滴定板布局。 v = RSV病毒储备液（v1，第1批病毒储备液；v2，第2批病毒储备液；v3，第3批病毒储备液），N = 阴性对照孔，X = 添加培养基。颜色编码仅用于辅助可视化板布局。

图 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
A549	ATCC	CCL-185	由昆士兰大学Keith Chappell博士提供
病毒株
RSV A2	ATCC	VR-1540	批号 60430286
试剂
丙酮	Merck	1000142511
Alexa-Fluor 驴抗山羊IgG（4 °C保存）	Life Technologies	A11055
CMC钠盐粉末	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM（无血清，3.7 g/L NaHC，P/S）（4 °C保存）	Scientific Services – 组织培养		MCRI内部供应
胎牛血清（-20 °C分装保存，每份50 mL）	Interpath	SFBS-F
山羊抗RSV抗体	Merck	AB1128
人多克隆抗呼吸道合胞病毒（RSV）血清（-20 °C分装保存，每份45 µL）	BEI Resources	NR-4022	注册后可通过BEI Resources免费申领。该血清属于人抗RSV血清和免疫球蛋白系列（NR-32832）之一
M199粉末	Life Technologies	31100035
脱脂奶稀释封闭液（4 °C保存）	Australian Biosearch	50-82-01
青霉素/链霉素（-20 °C分装保存，每份6 mL）	Life Technologies	15140122
Milli-Q dispenser提供的s.d.H2O	Merck		内部配制
用于培养的无菌1×PBS（4 °C保存）	Scientific Services – 组织培养		MCRI内部供应
Tween 20 聚山梨酯	Sigma-Aldrich	9005-64-5
通用耗材
锥形Falcon管（50 mL）	Invitro Technologies	FAL352070
滤器单元 0.22 µm（500 mL）	Thermo Fisher	NAL5660020
无菌Eppendorf管（1.5 mL）	Australia PL	AM12400
无菌平底板（96孔，带盖）	Interpath	655180
无菌U型底板（96孔，带盖）	Interpath	650180
5 mL 移液管	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
10 mL 移液管	Interpath	607180
25 mL 移液管	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
移液枪头 1–200 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个）	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
移液枪头 5–20 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个）	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
移液枪头 100–1000 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1000个）	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
移液枪头 1–10 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1001个）	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
仪器与软件
ELISpot读板仪系统	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot 软件版本 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007