使用电化学发光法检测人胰岛自身抗体

摘要

来源：Gu, Y. 等，人胰岛自身抗体的电化学发光检测方法。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了人血清中胰岛自身抗体的电化学发光检测。血清中的抗体将钌标记的抗原与生物素化的捕获抗原连接，形成复合物，通过电化学发光测定进行检测。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 缓冲液配制

1. 标记缓冲液（2倍磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.9）：在400 mL去离子蒸馏水（DD）中加入100 mL 10倍PBS，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.9。
2. 3 mM 生物素（Biotin）：将1 mg 生物素溶解于588 µL标记缓冲液中。
3. 3 mM Sulfo-tag：将150 nmol Sulfo-tag溶解于50 µL标记缓冲液中。
4. 抗原缓冲液（5% BSA）：在500 mL 1倍PBS中加入25 g牛血清白蛋白（BSA）。
5. 配制0.5 M乙酸溶液。
6. 1.0 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）：配制1 M Tris-HCl缓冲液，并用HCl调节pH至9.0。
7. 包被缓冲液（3% Blocker A）：在500 mL 1倍PBS中加入15 g Blocker A。
8. 洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）：在5000 mL 1倍PBS中加入2.5 mL Tween 20。
9. 读板缓冲液（2倍含表面活性剂的Read Buffer T）：在500 mL去离子蒸馏水中加入500 mL 4倍含表面活性剂的Read Buffer T（材料表）。
10. 将生物素（Biotin）和Sulfo-tag储存于-20 °C冰箱中。
    注意：生物素和Sulfo-tag溶液应在标记操作前新鲜配制。

2. 使用生物素和磺化标记物标记人胰岛自身抗原

注意：为了获得更高效的标记反应，建议使用高浓度的抗原（≥0.5 mg/mL）。

1. 确定人胰岛自身抗原与生物素（Biotin）及磺化标签（Sulfo-tag）的摩尔比。
   1. 通过将抗原质量除以其分子量，计算抗原的摩尔数。
   2. 对于分子量较小（≤10 kd）的抗原，使用1:5的摩尔比；对于分子量较大（>50 kd）的抗原，使用1:20的摩尔比。
   3. 通过将摩尔数除以其浓度，计算所需生物素或磺化标签的体积。
2. 按照1:5的摩尔比，将人胰岛自身抗原与生物素或磺化标签混合。
   注意： 若蛋白处于Tris或甘氨酸缓冲体系中，应使用尺寸排阻离心柱将其置换至pH为7.9的2×PBS缓冲液中。
3. 由于生物素和磺化标签对光敏感，需用铝箔包裹反应管。在室温（RT）下孵育1小时。
4. 在孵育期间，通过向离心柱中加入2×PBS缓冲液三次，对离心柱进行预处理。每次以1000 × g离心2分钟。
   注意： 目前标记反应仍通过桥接作用持续进行，需及时终止。
5. 通过纯化标记后的人胰岛自身抗原来终止标记反应。纯化时，将抗原溶液通过离心柱，并以1000 × g离心2分钟。
6. 利用抗原蛋白的总量和最终体积，测定标记抗原的浓度（µg/µL）。
   注意： 每次通过离心柱后，标记抗原的大致回收率为90–95%。
7. 将标记抗原分装，并于-80 °C保存。

3. 确定检测中两种标记抗原的最佳浓度和比例（棋盘滴定法）

1. 准备两个血清样本，一个为高阳性样本，另一个为阴性样本，每个样本总体积为 200 µL。
2. 取 4 µL 血清，加入 1x PBS，使每孔终体积为 20 µL，用于 96 孔聚合酶链式反应（PCR）板。使用半块板处理高阳性样本，另半块板处理阴性样本，如图 1A所示。
3. 加入 10 µL 生物素（Biotin）和 10 µL 亚磺酰标记抗原（Sulfo-tag labeled antigen），并对两种不同标记的抗原进行系列稀释，如图 1A所示。一种标记抗原进行横向系列稀释，另一种标记抗原进行纵向系列稀释。
4. 继续执行 5.3 至 9.1 节中描述的其余检测步骤。
5. 计算高阳性样本的信号与阴性样本相应信号的比值，如图 1B所示。
6. 通过选择阳性与阴性信号比值最高或接近最高的点，确定生物素和亚磺酰标记抗原的最佳浓度。在确定比值时，应考虑阴性样本的低背景信号。
   注意：检测第 1 天包括第 4 至第 6 步。

4. 使用正确浓度的生物素/磺化标记抗原制备抗原缓冲液

1. 根据棋盘式滴定试验选择每种抗原的合理浓度。
2. 每块板准备 3 mL 抗原溶液，使用生物素/磺化标记抗原的合理浓度配制抗原缓冲液。

5. 将血清样本与标记抗原孵育

注意：本节包含两种实验方案，一种不使用血清酸处理，另一种使用血清酸处理。除胰岛素自身抗体（IAA）检测外，所有胰岛自身抗体检测均采用从步骤5.1至5.5的常规方案（不进行血清酸处理）；而IAA检测则跳过这些步骤，采用从步骤5.6至5.9的血清酸处理方案。

1. 取4 µL血清，加入1×PBS，使每孔终体积为20 µL，适用于96孔PCR板。
2. 每孔加入20 µL标记的抗原溶液。
3. 用封板膜覆盖PCR板，避免光照。
4. 将PCR板置于摇床（低速）上，室温孵育2小时。
5. 将PCR板放入4 °C冰箱中，过夜孵育（18 - 24小时）。
   注意：以下从步骤5.6到5.9的实验流程仅适用于IAA检测，其他自身抗体检测应跳过这些步骤。
6. 每个血清样本取15 µL血清，与18 µL 0.5 M乙酸混合，室温孵育45分钟。
7. 根据棋盘滴定实验结果，使用抗原缓冲液配制含有适当浓度Biotin和Sulfo-tag标记抗原的抗原溶液。在新的PCR板中，每孔加入35 µL含Biotin和Sulfo-tag标记抗原的抗原缓冲液。
8. 在完成45分钟孵育（步骤5.6）之前，向抗原板（步骤5.6）每孔侧壁加入8.3 µL 1 M Tris pH 9.0缓冲液。注意避免Tris缓冲液与抗原溶液过早混合。立即从步骤5.6中取25 µL经酸处理的血清转移至各孔，并轻轻振荡混匀。用封板膜覆盖PCR板，避免光照。
9. 将PCR板置于摇床（低速）上，室温孵育2小时，随后放入4 °C冰箱中过夜孵育（18 - 24小时）。

6. 准备链霉亲和素包被板

1. 从4 °C冰箱中取出链霉亲和素包被板，使其恢复至室温。
2. 当链霉亲和素包被板达到室温后，向每孔中加入150 µL 3% 封闭液A。
3. 用密封膜封好PCR板。
4. 将板置于4 °C冰箱中过夜孵育。
   注意：检测第2天包括步骤7至步骤9。

7. 将血清/抗原孵育液转移至链霉亲和素包被板

1. 第二天，从冰箱中取出链霉亲和素包被板，弃去板中的缓冲液。在实验台上铺一些干燥的纸巾，将板倒扣在纸巾上轻拍，直至孔中无残留缓冲液。
2. 每孔加入 150 µL PBST，填满空的链霉亲和素板，随后弃去 PBST，共洗涤三次。
3. 将 30 µL 血清/抗原孵育液转移至链霉亲和素板的每个孔中。
4. 用铝箔覆盖板以避光，在室温下低速振荡孵育 1 小时。

8. 洗涤酶标板并加入读板缓冲液

1. 弃去孔板中的孵育液。每孔加入 150 µL PBST，弃去孔板中的 PBST，共洗涤三次。
2. 洗涤后，每孔加入 150 µL 读板缓冲液。
   注意：应避免溶液中产生气泡，因为气泡会影响酶标仪对孔板的读数结果。

结果

图1：用于确定检测阳性阈值的ROC曲线。 99^th 特异性在对应85%灵敏度时的百分位数被选为指标值，表示为0.023。该检测的上限值来源于100名健康对照个体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人重组前胰岛素蛋白（PINS）	AmideBio	Human Proinsulin, Rec
人重组GAD65蛋白	Diamyd	rhGAD65
人重组IA-2蛋白	Creative BioMart	IA2
1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
10x PBS，pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011-044
牛血清白蛋白（BSA）	SIGMA-ALORICH	A7906-500G
96孔PCR板	Fisher	14230232
链霉亲和素包被板	MSD	L15SA
Zeba尺寸排阻离心柱	Thermo Fisher Scientific	89890
Tween-20	Fisher	BP337-500
HCl	Fisher	A144-500
NaOH	Fisher	SS255-1
Trizma Base	Fisher	BP152-5
EZ-Link 生物素	Thermo Fisher Scientific	PI21329
Sulfo-tag	MSD	R91AO-1
封闭剂A	MSD	R93AA-1
含表面活性剂的4x读板缓冲液T	MSD	R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-生物素	ThermoScience	21329
Sulfo-TAG	MSD	R91AO-1
96孔聚合酶链式反应（PCR）板	Fisher brand	14230232
96孔链霉亲和素板	MSD GOLD	L 15SA-1
Zeba离心脱盐柱	ThermoScience	PL208984
96孔板振荡器	Perkin Elmer	1296-003
酶标仪	MSD	QuickPlex SQ120
带转篮式转子的台式离心机	Beckman	Allegra X-15R