使用电化学发光测定法检测人胰岛自身抗体

摘要

来源:Gu， Y. et al.， 人胰岛自身抗体的电化学发光测定。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频展示了人血清中胰岛自身抗体的电化学发光检测。血清中的抗体将钌偶联抗原与生物素化捕获抗原桥接，形成通过电化学发光测量检测的复合物。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 缓冲区准备

1. 标记缓冲液（2 x 磷酸盐缓冲盐水，（PBS），pH 7.9）:在 400 mL 蒸馏去离子 （DD） 水中，加入 100 mL 10x PBS，用氢氧化钠 （NaOH） 将 pH 值调节至 7.9。
2. 3 mM 生物素:将 1 mg 生物素溶解在 588 μL 标记缓冲液中。
3. 3 mM Sulfo-tag:将 150 nmol Sulfo-tag 溶解在 50 μL 标记缓冲液中。
4. 抗原缓冲液 （5% BSA）:在 500 mL 1x PBS 中，加入 25 g 牛血清白蛋白 （BSA）。
5. 制备 0.5 M 乙酸溶液。
6. 1.0 M Tris-HCl 缓冲液 pH 9.0:制备 1 M Tris-HCl 缓冲液，并用 HCl 将 pH 调节至 9.0。
7. 包被缓冲液（3% 封闭剂 A）:在 500 mL 的 1x PBS 中，加入 15 g 封闭剂 A。
8. 洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）:在 5000 mL 的 1x PBS 中，加入 2.5 mL 的 Tween 20。
9. 读数缓冲液（含表面活性剂的 2x 读取缓冲液 T）:在 500 mL DD 水中，加入 500 mL 含表面活性剂的 4x 读取缓冲液 T（材料表）。
10. 将生物素和磺胺标签储存在 -20 °C 冰箱中。
    注意:生物素和 Sulfo 标签溶液都应在标记程序之前始终新鲜制备。

2. 用生物素和 Sulfo 标签标记人胰岛自身抗原

注:建议使用高浓度抗原 ≥0.5 mg/mL，以实现更高效的标记反应。

1. 确定人胰岛自身抗原的生物素和 Sulfo 标签的摩尔比。
   1. 通过将抗原重量除以分子量来获得抗原摩尔数。
   2. 对于分子量较小的抗原 （≤10 kd），使用 1:5 的摩尔比，对于分子量较大的抗原 （>50 kd），使用 1:20 的摩尔比。
   3. 通过将摩尔数除以其浓度来计算生物素或 Sulfo 标签的体积。
2. 将人胰岛自身抗原与生物素或 Sulfo 标签混合，摩尔比为 1:5.
   注意:应使用施胶离心柱将 tris 或甘氨酸缓冲液系统中的蛋白质交换为 pH 值为 7.9 的 2x PBS 缓冲液。
3. 由于生物素和 Sulfo 标签对光敏感，因此请用铝箔覆盖反应管。在室温 （RT） 下孵育反应 1 小时。
4. 在孵育过程中，通过将 2x PBS 缓冲液分配到柱中 3 次来灌注离心柱。每次以 1000 x g 离心溶液 2 分钟。
   注意:目前，通过桥接的标记反应仍在发生，需要停止。
5. 通过纯化标记的人胰岛自身抗原来终止标记反应。要纯化，将自身抗原通过离心柱，并以 1000 x g 离心柱 2 分钟。
6. 使用抗原蛋白的量和最终体积确定标记的抗原浓度 （μg/μL）。
   注意:粗略地，每次离心柱通过后，标记抗原将保留 90 - 95%。
7. 分装标记的抗原并将标记的抗原储存在 -80 °C。

3. 定义用于检测的两种标记抗原的最佳浓度和比例（Checker Board 检测）

1. 准备两个血清样品，一个高阳性和一个阴性，每个样品的总体积为 200 μL。
2. 分装 4 μL 血清并加入 1x PBS，直到 96 孔聚合酶链反应 （PCR） 板的最终体积为每孔 20 μL。将板的一半用于高阳性样品，另一半用于阴性样品，如图 1A 所示。
3. 加入 10 μL 生物素和 10 μL Sulfo 标签标记的抗原，并对两种不同标记的抗原进行连续稀释，如图 1A 所示。对一种标记抗原进行水平连续稀释，对另一种标记抗原进行垂直连续稀释。
4. 继续 5.3 至 9.1 中描述的其余检测步骤。
5. 计算来自高阳性样本的信号与来自 图 1B 所示的负样本的每个相应信号的比率。
6. 通过选择阳性与阴性比率最高或接近最高的点，确定生物素和 Sulfo 标签标记抗原的最佳浓度。考虑来自负样品的低背景信号来确定比率。
   注意:检测第 1 天包括第 4 步至第 6 步。

4. 使用正确浓度的生物素/磺基标签标记抗原制备抗原缓冲液

1. 根据棋盘检测选择每种抗原的合理浓度。
2. 每板制备 3 mL 抗原溶液，使用合理浓度的生物素/Sulfo 标签标记抗原作为抗原缓冲液。

5. 用标记抗原孵育血清样品

>注意:本节有两种方案，一种没有血清酸处理，另一种有血清酸处理。除胰岛素自身抗体 （IAA） 测定外，所有胰岛自身抗体检测都使用常规方案，从步骤 5.1 到 5.5 没有血清酸处理，而 IAA 检测跳过这些步骤，使用步骤 5.6 到 5.9 的血清酸处理方案。

1. 分装 4 μL 血清并加入 1x PBS，直到 96 孔 PCR 板的最终体积为每孔 20 μL。
2. 每孔加入 20 μL 标记的抗原溶液。
3. 用密封膜盖住 PCR 板以避免光线。
4. 将板放在振荡器（低速）上，在 RT 下放置 2 小时。
5. 将板放入4°C冰箱中并孵育过夜（18-24小时><）。 注意:以下步骤 5.6 至 5.9 的方案仅用于 IAA 测定，其他自身抗体测定跳过这些步骤。
6. 每个血清样品将 15 μL 血清与 18 μL 0.5 M 乙酸混合。在 RT 下孵育该混合物 45 分钟。
7. 根据棋盘检测法，使用抗原缓冲液制备具有合理浓度的生物素和 Sulfo 标签标记抗原的抗原溶液。在每个孔中，将 35 μL 含有生物素和 Sulfo 标签标记抗原的抗原缓冲液分装到新的 PCR 板中。
8. 在 45 分钟孵育（步骤 5.6）步骤完成之前，在抗原板上每个孔的一侧添加 8.3 μL 1 M Tris pH 9.0 缓冲液（步骤 5.6）。限制 Tris 缓冲液和抗原之间的混合很重要。立即将 25 μL 血清（在步骤 5.6 中用酸处理）转移到每个孔中并搅拌溶液。用密封膜盖住 PCR 板以避免光线。
9. 将板放在振荡器（低速）上，在室温下放置2小时。将板放入4°C冰箱中，让板孵育过夜（18-24小时）。

6. 准备链霉亲和素板

1. 从 4 °C 冰箱中取出链霉亲和素板，让板进入 RT。
2. 链霉亲和素板在 RT 下后，向每个孔中加入 150 μL 3% 封闭剂 A。
3. 用密封膜盖住 PCR 板。
4. 将板在 4 °C 冰箱中孵育过夜。
   注:检测第 2 天包括第 7 步至第 9 步。

7. 将血清/抗原孵育液转移至链霉亲和素板

1. 第二天，从冰箱中取出链霉亲和素板，丢弃板中的缓冲液。将一些干纸巾放在桌子上，将板倒置敲击，直到孔内不再有缓冲液。
2. 每孔用 150 μL PBST 填充空链霉亲和素板，并从板中丢弃 PBST，总共洗涤 3 次。
3. 将每孔 30 μL 血清/抗原孵育液转移到链霉亲和素板中。
4. 用箔纸盖住板以避免光线。在 RT 下以低设置摇动板 1 小时。

8. 洗涤板并添加读取缓冲液

1. 丢弃板中的孵育物。每孔加入 150 μL PBST，并从板中丢弃 PBST，总共洗涤 3 次。
2. 洗涤后，每孔添加 150 μL Reading 缓冲液。
   注意:防止溶液中出现气泡很重要，因为这会影响读板机读取板的方式。

结果

图 1:用于确定检测阳性临界值的 ROC 曲线。选择了对应于 85% 敏感性的第 99^个特异性百分位数，并表示为指数值 0.023。该测定的上限取自 100 名健康对照。

材料