一种用于检测免疫球蛋白 G 的纸质免疫分析法

摘要

来源：Peng, Y. 等，抗体与纤维素纸片的共价结合及其在裸眼比色免疫测定中的应用。J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了一种基于纸张的免疫分析方法，该方法采用胺基功能化的纤维素圆片，并通过戊二醛进行交联。首先将特异性识别IgG-Fc段的捕获抗体共价固定在圆片上，随后加入免疫球蛋白G和辣根过氧化物酶标记的检测抗体，若存在免疫球蛋白G，则发生显色反应，通过颜色变化予以确认。

方案

1. 在纤维素纸片上接枝胺基官能团

1. 准备一块尺寸为 1 cm × 1 cm 的方形纸片，以及使用直径为 6.0 mm 的 1 号纤维素滤纸（中流速滤纸）通过打孔器制备的 100 个纸盘。
2. 为了在纸盘上引入 -NH₂ 基团，在通风橱中，将 1 ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APS）和 10 ml 丙酮混合于一个 50 ml 玻璃瓶中。将纸盘加入 freshly 制备的 APS 试剂混合液中，在室温下以 200 rpm 转速振荡孵育 5 小时。
   注意： 操作 APS 和丙酮时应在通风橱中进行。
3. 将玻璃瓶中的过量溶液倾倒至有机废液容器中。
4. 向玻璃瓶中加入 10 ml 丙酮，充分混匀后完全倾倒，以去除未反应的 APS 及其他杂质。重复此步骤两次。
5. 将纸盘平铺在纸巾上，置于 110 °C 烘箱中加热 3 小时。待纸盘冷却后，储存于 50 ml 离心管中，室温保存。
6. 采用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）检测纤维素方形纸片上胺基的接枝情况，具体步骤如下（图 1A）：
   1. 打开计算机并启动 FTIR 光谱仪。
   2. 打开 FTIR 光谱仪的配套软件。
   3. 点击“Measurement → Initialize”（测量 → 初始化）。初始化完成后，“BS: KBr”、“Lamp: Infrared”（光源：红外）和“Laser”（激光）对应的指示框将变为绿色。
   4. 在指示框下方选择“Data”（数据），并依次设置“Measurement Mode”（测量模式）为“%Transmittance”（%透射率），“Apodization”（切趾函数）为“Happ-Genzel”，“No. of Scans”（扫描次数）为“45”，“Resolution”（分辨率）为“4.0”，“Range (cm-1)”（范围）为“Min: 400, Max: 4000”。
   5. 点击“Measure”（测量）。
   6. 为背景数据选择“Data file”（数据文件），并填写备注信息。
   7. 点击“BKG”（背景）以获取背景基线。
   8. 将方形纸片固定在薄膜样品 holder 上。
   9. 为样品数据选择“Data file”（数据文件），并填写备注信息。
   10. 点击“Sample”（样品）以获取样品的光谱图。
   11. 关闭 FTIR 光谱仪软件，并关闭计算机。
7. 重复上述步骤（步骤 1.1 至 1.6），制备胺基功能化的 113 号纤维素方形纸片和纸盘（快速流速滤纸），并获取 113 号纸片的 FTIR 光谱图（图 1B）。

2. 用于免疫球蛋白 G（IgG）检测的基于纸张的酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 向一个20 ml的玻璃瓶中加入5 ml 0.05%戊二醛溶液（用50 mM PBS缓冲液配制，pH 7.4）。将15个氨基功能化的中流速滤纸圆片浸入该溶液中，在室温下振荡孵育1小时。
   1. 同时，重复步骤2.1，制备另外15个醛基功能化的快速流速滤纸圆片。
      注意：操作戊二醛时应在通风橱中进行。
2. 为去除滤纸圆片上未反应的戊二醛，将15个中流速滤纸圆片放入一个15 ml离心管中，另将15个快速流速滤纸圆片放入另一个15 ml离心管中。每管加入5 ml去离子水，振荡10秒，然后用移液器吸去水相。重复该洗涤步骤两次，以彻底去除未反应的戊二醛。
3. 将滤纸圆片置于37 °C烘箱中干燥。
4. 分别向每个中流速和快速流速滤纸圆片上加入5 µl和8 µl的0.025 mg/ml小鼠IgG-Fc片段抗体，孵育20分钟。
5. 在不移除抗体的情况下，向每张滤纸圆片上加入10 µl 50 mM PBS（pH 7.4），继续孵育40分钟，以完成氨基与醛基的反应。
6. 将滤纸圆片置于纸巾上，用0.2 ml洗涤缓冲液清洗。重复洗涤三次。
7. 将滤纸圆片在37 °C烘箱中干燥。
8. 在室温下用15 µl封闭缓冲液对滤纸圆片进行封闭处理，持续10分钟。
9. 将每张滤纸圆片置于纸巾上，用0.2 ml洗涤缓冲液清洗。重复洗涤三次。
10. 运行IgG标准品。
    1. 将不同浓度的IgG溶液（例如，0、10、125、250和500 ng/ml，溶于PBS中）各取10 µl，每种浓度设三个重复，分别加样至各圆片上。室温孵育1小时。
11. 将滤纸圆片置于纸巾上，用0.2 ml洗涤缓冲液清洗。重复洗涤三次。
12. 向每张滤纸圆片上加载10 µl HRP标记的小鼠IgG-Fc片段抗体（1:10,000稀释，溶于10 mM PBS，pH 7.4），室温孵育1小时。
13. 将滤纸圆片置于纸巾上，用0.2 ml洗涤缓冲液清洗。重复洗涤三次。
    注意：无需完全去除洗涤缓冲液，因为缓冲液的存在不会影响实验结果。
14. 向每张滤纸圆片上加载10 µl TMB与过氧化氢的混合液。
15. 孵育5分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄所有滤纸圆片的图像。
    注意：在图2A中，“0”代表经过捕获抗体固定化处理，并加入抗体-HRP/TMB溶液但未加IgG血清的滤纸圆片。
16. 使用Image J软件分析图像中每张滤纸圆片的信号强度。
    1. 将步骤3.15中拍摄的图像转换为“.tif”格式。
    2. 打开“Image J”软件。
    3. 点击“文件 → 打开”，选择待分析的图像。
    4. 选择工具栏中的“椭圆”形状工具。
    5. 点击“图像 → 类型 → 32位”。
    6. 点击“编辑 → 反转”。
    7. 点击“分析 → 测量”。
    8. 将数据复制到电子表格中进行进一步分析。

结果

图1. 未处理与APS处理的中速方形滤纸（A）和快速方形滤纸（B）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。A. 未处理中速方形滤纸的光谱与APS处理中速方形滤纸的光谱相似。APS处理方形滤纸在902–1,170 cm^-1 和1,210–1,500 cm^-1 波数范围内的吸收峰强度增加，分别归属于Si-O-纤维素和SiOC-H基团的C-H变形振动。在1,650 cm^-1 和2,885 cm^-1 处吸收峰的增强分别归因于硅烷丙基部分的-NH₂ 弯曲振动和CH₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维素滤纸，1号规格（中速流动滤纸）	GE Healthcare Pte Ltd Singapore	1001 110
纤维素滤纸，113号规格（快速流动滤纸）	Sigma-Aldrich, Singapore	1113-320
3-氨基丙基三甲氧基硅烷	Sigma-Aldrich, Singapore	T1255	>96%
戊二醛	Sigma-Aldrich, Singapore	G6257	II型，25% 水溶液
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, Singapore	A2153
脱脂奶粉	Louis François		由新加坡 Kitchen Capers 公司包装
Tris碱	Promega	H5135
高碘酸钠	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM	567441
NaOH	Merck	106462
HCL	Merck	100317
磷酸盐缓冲液（PBS）	N/A	N/A	PBS 含有 137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.0 mmol/L Na2HPO4 和 1.5 mmol/L KH2PO4，用水配制，并用 0.1 mol/L NaOH 或 0.1 mol/L HCl 调节至 pH 7.4
丙酮	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore	9005-68
TMB 与过氧化氢溶液混合物	1-Step ultra TMB-ELISA 溶液，Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
亲和纯化的山羊抗小鼠 IgG-Fc 包被抗体	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
小鼠参考血清	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9.5 mg/mL
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG-Fc 检测抗体	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
设备
傅里叶变换红外光谱仪	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
烘箱	NUVE FN500	N/A
Turbo mixer VM-2000	MYC LTD	N/A
Image J	RGB，免费下载	N/A