一种用于评估抗体作用的体外检测方法 Candida tropicalis 生物膜

摘要

来源：Chandley, P.，等。一种基于可溶性四氮唑还原法的检测抗体对Candida tropicalis 生物膜作用的实验方法。视觉化实验杂志（2022）。

本视频演示了一种 体外 研究抗体对真菌生物膜作用的技术。致病性真菌 Candida tropicalis 分泌一种毒力因子——分泌型天冬氨酸蛋白酶2（Sap2），促进生物膜的形成。通过引入含有抑制生物膜成熟作用的Sap2特异性抗体的热灭活血清后，采用显色法检测真菌细胞的活力。

方案

1. C. tropicalis 生物膜形成

1. 按照前述方法在96孔平底聚苯乙烯微孔板中制备Candida生物膜（图1）。
2. 使用多通道移液器将100 µL C. tropicalis菌液（来自上述制备的10⁶ 个细胞/mL储备液）加入96孔微孔板中（图2A）。最后两列（第11和12列）不加真菌细胞，分别设为“无真菌加血清”和“无真菌无血清”的阴性对照组。仅向第11和12列每孔加入100 µL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) 培养基。
3. 用盖子和铝箔纸覆盖微孔板，于37 °C静置培养24小时。
4. 次日，使用多通道移液器小心吸除培养基（避免接触或破坏生物膜）。将微孔板倒置轻拍于吸水纸上，以去除残留液体。
5. 使用多通道移液器每孔加入200 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。沿孔壁缓慢加入PBS，避免冲击生物膜。再用多通道移液器小心吸除PBS。重复PBS洗涤2次（共洗涤3次）。
6. 为去除多余PBS，在生物安全柜内室温条件下将微孔板敞盖晾干30分钟。

2. 用抗体处理生物膜

注意： 现可对生物膜进行处理，以评估抗体对生物膜成熟过程的抑制作用。实验中使用小鼠血清作为多克隆抗体的来源。分别采集 Sap2 免疫组（Sap2-albicans、Sap2-tropicalis 和 Sap2-parapsilosis）及假免疫对照组小鼠的眶后静脉血，并分离血清。采用 Sap2 特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）确认血清中抗 Sap2 抗体的存在。

1. 使用前将血清（多克隆抗体来源）在 56 °C 下热灭活 30 分钟，以排除补体在抑制活性中的作用。在进行血清稀释前，先完成血清的热灭活。
   注意： 使用假免疫小鼠、免疫前小鼠以及 Sap2 特异性抗体耗竭血清作为额外对照。抗体耗竭血清的制备参照先前的研究。在本实验方案中测试的系列稀释度（1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1,600、1:3,200、1:6,400 和 1:12,800）中，观察到 1:25、1:50 和 1:100 稀释度可抑制生物膜成熟；因此选择 1:50 稀释度，以在抑制效果与血清消耗之间取得平衡。
2. 用无菌 RPMI 1640 MOPS 培养基将热灭活后的血清样品进行 1:50 的系列稀释。所有待测血清样品均采用相同的 1:50 稀释度，用于检测对生物膜成熟的抑制作用。
3. 向 96 孔微孔板的每孔中加入 100 µL 已选定的血清稀释液。每个样品设两个复孔，具体加样布局参见附图（图 2B）。
   1. 第 10 列不加血清稀释液，仅加入 RPMI 1640 MOPS 培养基，作为仅含真菌的阳性对照。
      注意： 第 10 列的 G1–G8 和 H1–H8 行最初含有 RPMI-MOPS 中的真菌细胞。然而，在 24 小时后即使向第 10 列添加了 RPMI-MOPS，G1–G8 行作为 PBS 对照，H1–H8 行作为无血清对照。
   2. 第 11 列各孔均加入 1:50 稀释的血清，作为无真菌加血清阴性对照。
   3. 第 12 列各孔均不加血清稀释液，作为空白对照，即无真菌无血清阴性对照。
4. 用盖子盖好微孔板，并包裹铝箔。于 37 °C 培养 24 小时。

3. 生物膜代谢活性的评估

1. 第二天，使用多通道移液器小心吸除血清（避免接触或破坏生物膜）。将培养板倒置，轻轻在吸水纸上轻拍，以去除残留的血清。
2. 使用多通道移液器，每孔加入 200 µL 1× PBS 进行洗涤，加液时沿孔壁加入，避免破坏生物膜。再用多通道移液器小心吸除 PBS，并重复 PBS 洗涤 2 次（共洗涤 3 次）。将培养板置于生物安全柜内室温下（不加盖）晾干 30 分钟，以去除残留的 PBS。
3. XTT（2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四氮唑-5-羧苯胺）/甲萘醌溶液的配制：
   1. 用无菌乳酸林格液配制 XTT 溶液，浓度为 0.5 g/L。将 25 mg XTT 溶解于 50 mL 经滤膜除菌的乳酸林格液中。分装为每管 10 mL，用铝箔包裹后，于 -80 °C 保存。
   2. 配制 10 mM 甲萘醌储备液。将 8.6 mg 甲萘醌溶解于 5 mL 丙酮中，分装为每管 50 µL，共 100 管。分装后于 -80 °C 保存。
   3. 使用前现配 XTT/甲萘醌工作液：取 10 mL XTT 溶液，加入 1 µL 甲萘醌，混匀，得到终浓度为 1 µM 的工作液。
4. 向 96 孔微量培养板的每孔中加入 100 µL XTT/甲萘醌工作液。盖上盖子后用铝箔包裹，于 37 °C 避光孵育 2 小时。
5. 将每孔中的 80 µL 有色上清液转移至新的 96 孔板中。在 490 nm 波长下测定吸光度。
6. 计算第 10 列各孔吸光度值的平均值（真菌单独培养的阳性对照），作为参考值，用于根据公式 (1) 计算各血清样本的生物膜抑制率。
   生物膜抑制率 (%) = 100 - × 100 (1)

结果

图1：Candida tropicalis 生物膜的成像。（A）使用倒置显微镜观察在去除RPMI培养基后，于96孔微孔板底部形成的Candida tropicalis生物膜。图像通过明场显微镜拍摄（未使用染色）。（B）经结晶紫染色后，在96孔微孔板底部形成的C. tropicalis生物膜的可视化图像。（C）利用扫描电子显微镜观察在玻璃片上形成的C. tropicalis生物膜。比例尺 = 100 µm（A,B），10 µm（C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546021
1× PBS	-	实验室自配	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g 水 500 mL，调 pH 至 7.4
50 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546041
96 孔微孔板	Nunc	442404
培养箱	通用
甲萘醌	Sigma	M5625
微孔板读板仪	通用
多通道移液器及吸头	通用
培养皿	Tarson	460090
林格氏乳酸钠溶液	-	实验室自配	氯化钠 0.6 g，乳酸钠 0.312 g，氯化钾 0.035 g，氯化钙 0.027 g，水 100 mL，调 pH 至 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
XTT	Invitrogen	X6493