一种基于免疫荧光的空肠冷冻切片中簇细胞可视化方法

摘要

来源：Mizutani, Y. 等，利用抗磷酸化Girdin抗体在小鼠空肠游离冰冻切片中可视化肠道簇细胞。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种基于免疫荧光的方法，用于在游离的小鼠空肠冷冻切片中观察肠杯状细胞。在肠绒毛内，管腔顶端的绿色荧光与延伸的红色根状结构共定位，表明存在杯状细胞。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备工作

1. 配制 10 L 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 32.27 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）、4.5 g 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）和 80.0 g 氯化钠（NaCl）加入超纯水中，定容至 10 L。溶液于室温（RT）保存。
2. 配制 200 mL PBS-T：取步骤 1.1 中的 PBS 200 mL，加入 100 µL 聚氧乙烯（10）辛基苯基醚，终浓度为 0.05%（体积比）。于室温保存。
3. 佩戴手套和护目镜，配制 50 mL 15% 蔗糖的 10% 缓冲中性甲醛溶液：将 7.5 g 蔗糖加入 10% 缓冲中性甲醛溶液（材料表）中，定容至 50 mL。溶液于室温保存。
   注意：吸入或皮肤/眼部接触 10% 缓冲中性甲醛溶液中的甲醛可能具有危害性。操作时需谨慎。
4. 配制 1.5 mL 浓度为 200 单位/mL 的鬼笔环肽-荧光染料偶联物储备液：将鬼笔环肽-荧光染料偶联物（每瓶 300 单位，冻干粉末，激发波长和发射波长分别为 581 nm 和 609 nm）溶于 1.5 mL 甲醇中。溶液避光保存于 -20 °C。
5. 配制 5 mg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）储备液：将 10 mg DAPI 溶于 2 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。溶液避光保存于 -20 °C。
6. 配制 PBS 中 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液：将 0.5 g BSA 加入 10 mL PBS 中。4 °C 保存。
7. 使用剪钳去除 18 号直针的斜面针尖，并用镊子沿纵向夹压剪断端，使液体可通过针管内腔（图 1A1）。
   备注： 此处可暂停实验流程。

2. 动物解剖与空肠的分离

1. 小鼠灌注固定
   1. 佩戴手套并在通风良好的区域操作。
   2. 准备一个 100 mL 玻璃烧杯、10% 缓冲中性甲醛溶液、手术器械（剪刀、镊子）、金属托盘、6-0 尼龙切断缝线、按步骤 1.7 准备的 18 号直针、22 号翼状针、20 mL 注射器。
   3. 从玻璃烧杯中吸取 20 mL 10% 缓冲中性甲醛溶液至 20 mL 注射器中，并将 22 号翼状针连接至注射器出口端。
   4. 在 50 mL 离心管中加入 1 g 明胶粉末至 20 mL PBS 中（终浓度为 5% 明胶），室温浸泡 15 分钟后，于 50 °C 水浴中静置孵育 15 分钟，不振荡。
   5. 短暂涡旋混匀后，继续在 50 °C 水浴中孵育 15 分钟，以彻底溶解明胶。将离心管置于室温备用。
   6. 通过颈椎脱位法处死成年小鼠。
   7. 将步骤 2.1.6 中的小鼠置于金属托盘上，使用手术器械沿剑突软骨处皮肤做一小切口。
   8. 用双手将切口向两侧扩大，暴露胸腔和腹腔区域。
   9. 切开腹膜以暴露膈肌，随后在两侧切开膈肌。
   10. 沿两侧腋前线剪开胸廓，再于胸腺位置横向剪除胸壁，暴露心脏。
   11. 在右心耳处做一小切口以排出血液，将 22 号翼状针插入左心室心尖部，推动注射器活塞，用 10% 缓冲中性甲醛溶液灌注组织。
   12. 暴露盆腔器官后，从肛门处切断直肠末端，并通过剪断肠系膜将肠道与机体分离。
   13. 为分离空肠，从胃窦肛侧 4 cm 处切断肠道，弃去剩余小肠的肛侧部分。
   14. 用夹子将空肠段夹成两半，以便进行冲洗操作。将 20 mL 10% 缓冲中性甲醛溶液装入 20 mL 注射器，并将步骤 1.7 中准备的 18 号直针连接至注射器出口端。
   15. 从夹闭的空肠一端注入 10% 缓冲中性甲醛溶液，以冲洗肠腔内容物并固定肠腔表面（图 1A2）。
   16. 按照步骤 2.1.15 所述方法，通过注入 PBS 清洗肠腔。
   17. 按照步骤 2.1.15 所述方法，将液态明胶注入肠腔，以置换 PBS。
   18. 使用 6-0 尼龙切断缝线结扎缝合夹闭的空肠一端，向空肠内填充液态明胶后，再以缝线结扎封闭另一端（图 1A3）。
   19. 打四个缝线结，将香肠状的空肠节段适配至冷冻模具的凹陷部位（图 1A4）。
       注意： 对于具有 20 mm × 25 mm × 5 mm 凹陷区域的冷冻模具，建议使用长约 ~20 mm 的香肠状空肠节段。
   20. 将组织在含 15% 蔗糖的 10% 缓冲中性甲醛溶液（50 mL）中 4 °C 过夜浸泡。
       注意： 上述步骤可确保蔗糖提供冷冻保护作用，同时甲醛实现对明胶及组织的蛋白固定。经甲醛固定的明胶化明胶在室温下不融化，而未经固定的明胶化明胶在 4 °C 下保存时，于室温会融化。

3. 明胶填充的空肠组织的速冻

1. 通过在缝合结处切断空肠，获得三个两端结扎的香肠状空肠组织片段（图 1A4）。将香肠状片段排列于冷冻模具中，加入包埋剂以制备冷冻组织标本。
2. 将冷冻模具迅速置于液氮冷却的异戊烷中速冻。将冷冻模具在 -80 °C 下保存
   注意：本实验方案可在此暂停。

4. 使用游离冰冻切片对簇细胞进行免疫荧光染色

1. 冷冻切片
   1. 将冷冻切片机腔室温度（CT）和样品温度（OT）均设定为 -22 °C。将冷冻的组织块放入冷冻切片机腔室内的冷冻模具中，至少放置 15 分钟。
   2. 向一个 35 mm 培养皿中加入 3 mL PBS。
   3. 从冷冻模具中取出冷冻组织块，用剃刀片将其切成两半，以暴露空肠的横截面。将其中一半组织块固定在持样夹（冷冻切片机适配器）上，以便用剃刀片对切割平面进行切片。
   4. 将填充明胶的空肠组织切成 30 µm 厚的切片。使用冷冻镊子轻轻将切片转移至步骤 4.1.2 中准备好的 35 mm 培养皿中（图 2B，右侧）。
2. 一抗孵育
   1. 在 35 mm 培养皿中用 3 mL PBS-T 对游离切片进行洗涤，温和振荡（约 36 次/分钟），每次 5 分钟，共洗 3 次。
   2. 配制抗原修复液：将 0.3 mL 抗原修复液浓缩液（材料表）加入 2.7 mL 超纯水中。向含有游离切片的 35 mm 培养皿中加入 3 mL 抗原修复液。
   3. 盖上盖子，用乙烯基胶带密封培养皿与盖子之间的缝隙，在杂交孵育箱中于 50 °C 孵育 3 小时，期间不振荡。
   4. 从孵育箱中取出培养皿，在室温下冷却 20 分钟。移除乙烯基胶带后，用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
   5. 吸除 PBS-T，向切片上滴加 5 滴封闭液（材料表），在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟。
   6. 配制一抗溶液：将 5 µL 磷酸化-Y1798 girdin（pY1798）抗体（材料表）加入 495 µL 含 5% BSA 的 PBS 溶液中。向切片上加入 500 µL 一抗溶液（无需去除封闭液）。
   7. 将培养皿置于湿化孵育盒中，在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。
      注意：过夜孵育时间可延长至最多三个夜晚。
3. 二抗孵育
   1. 用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
   2. 配制稀释的 DAPI 储存液：取 2 µL DAPI 储存液（步骤 1.5），加入 998 µL PBS。
   3. 配制二抗溶液：476 µL 含 5% BSA 的 PBS 溶液、10.5 µL 稀释后的 DAPI 溶液、12.5 µL 鬼笔环肽-荧光染料偶联物储存液、1 µL 山羊抗兔 IgG-荧光染料偶联物（激发波长：496 nm，发射波长：520 nm）。
   4. 吸除 PBS-T 后，加入二抗溶液，置于避光孵育盒中，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
   5. 用 3 mL PBS-T 在温和振荡条件下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
   6. 最后一次洗涤后，吸除 PBS-T，替换为 3 mL 不含聚氧乙烯(10)辛基苯基醚的 PBS。将培养皿转移至体视显微镜下。
   7. 在 MAS 涂层白色玻片中央滴加 200 µL PBS，使用 P200 移液器吸头将一个空肠切片从培养皿转移至液滴中。
   8. 在体视显微镜下调整切片位置后，吸除切片周围残留的所有 PBS。
   9. 加入 20 µL 水溶性封片剂，并在其上方放置一张 20 × 20 mm 的盖玻片。
   10. 立即使用含二甲苯的封片剂密封盖玻片边缘。将玻片置于木制载片架上，在室温下静置 2–3 小时，使含二甲苯的封片剂固化。
       注意：本方案可在此处暂停。待含二甲苯的封片剂完全固化后，玻片可在室温下避光保存 2–3 周。

5. 共聚焦显微镜

1. 在共聚焦显微镜的63倍物镜上滴加镜油。将盖玻片朝下，把载玻片放置在载物台上。
2. 对在405、488和555 nm激光波长下获取的透射光（TC）图像进行数字化处理，并将图像保存为TIFF格式（.tiff）。
   注意：选择适合荧光染料的检测滤光片组（即激发/发射最大值：358/461 nm、490/525 nm和590/617 nm）。

结果

图1：小肠节段经明胶填充以实现冷冻切片形态学的保存
(A) 小鼠空肠腔内注射明胶操作步骤的示意图。(A1) 切除18号直针的斜面针尖，以避免刺穿肠壁。(A2) 从夹闭的空肠一端注入10%中性缓冲福尔马林溶液，以冲洗肠内容物并固定肠腔表面。(A3) 将液态明胶注入夹闭的空肠段，并用6-0尼龙缝线结扎两端 （黑色箭头）。(A4) 在原有缝线结扎点之间 （黑色箭头） 再添加四个缝线结 （白色箭头）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Slc:DDY 6周龄雌性小鼠	Chubu Kagaku Shizai	不适用
十二水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)	Wako	196-02835
二水合磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)	Wako	199-02825
氯化钠 (NaCl)	Wako	199-10665
曲拉通 X-100，聚氧乙烯(10)辛基苯基醚	Katayama Chemical	不适用
蔗糖	Wako	190-00013
10% 缓冲中性福尔马林溶液	Muto Chemical	20215	步骤 1.3.
鬼笔环肽-荧光染料偶联物，Alexa Fluor 594 鬼笔环肽	ThermoFisher Scientific	A12381
甲醇	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐)	ThermoFisher Scientific	D1306
N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)	Nacalai Tesque	13015-75
牛血清白蛋白	Sigma	A9647-10G
18号不锈钢直针	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0，60 cm 尼龙切割缝线，Crownjun	Kono Seisakusho	不适用
22号带翼针头	Terumo	SV-22DLK
20 mL TERUMO 注射器	Terumo	SS-20ES
50 mL 离心管	TPP	91050
15 mL Iwaki 离心管	Iwaki	2325-015
1.5 mL 微量离心管	Star	RSV-MTT1.5
明胶粉末，Gelare-blanc	Nitta Biolab	2809
冷冻组织标本包埋剂，O.C.T. Compound 118 mL 12 件装	Sakura FineTech	4583
冷冻模具，CRYO DISH No. 3，125 件装，孔尺寸 20 x 25 x 5 (mm)	Shoei Work's	1101-3
异戊烷	Nacalai Tesque	26404-75
Falcon 细胞培养皿 35 x 10 mm Easy-Grip	Corning	353001
抗原修复液浓缩液，Target Retrieval Solution pH 9 10x	Dako	S2367	步骤 4.2.2 中的抗原修复液浓缩液
蛋白封闭剂	Dako	X0909	步骤 4.2.5 中的封闭溶液
磷酸化-Y1798 girdin (pY1798) 抗体	Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X	28143	步骤 4.2.6 中的磷酸化-Y1798 girdin 抗体
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11034
水性封片剂，Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific	P36930
盖玻片，Matsunami 显微盖玻片 22 x 22 mm 100 片装，厚度 No.1	Matsunami Glass	C022221
Entellan New，基于二甲苯的显微镜封片剂	Merck Millipore	107961
MAS 涂层白片载玻片	Matsunami Glass	MI-MAS-01
木质标本盒 KO 型	Shoei Work's	99-40007
浸油 518 F 无荧光 20 ml	Zeiss	444960
移液器，Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
超纯水制备系统	Advantec	GS-590
塑料手套，Star 丁腈手套	Star	RSU-NGVM
冷冻切片机	Leica Microsystems	CM1950
超低温冰箱，SANYO 超低温	Sanyo	MDF-382
展示用冰箱	Nihon Freezer	NC-ME50EC
水浴锅，Thermominder SDminiN（用于在 50 °C 溶解明胶）	Taitec	0068750-000
杂交孵育器（用于 50 °C 抗原修复）	Taitec	HB-100
免疫染色孵育盒	Cosmo Bio	10DO
免疫组织化学用往复摇床（室温）	Taitec	NR-1
免疫组织化学用往复摇床（4 °C）	Tokyo Rika Kikai	MMS-3010
体视显微镜（用于组织操作）	Olympus	SZ61
体视显微镜（用于图 1B）	Leica Microsystems	M165FC
荧光显微镜（用于图 3）	Nikon	E800
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM700