一种基于免疫荧光的空肠冷冻切片中簇状细胞可视化的方法

Abstract

来源:Mizutani， Y. et al.， 使用抗磷酸化 girdin 抗体在自由漂浮的小鼠空肠冷冻切片中可视化肠簇细胞。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频演示了一种基于免疫荧光的方法，用于在自由漂浮的小鼠空肠冷冻切片中可视化肠簇细胞。在肠绒毛内，管腔尖端绿色荧光与扩展的红色小根块共定位表明存在簇状细胞。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 准备工作

1. 制备 10 L 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）:32.27 g 磷酸氢钠 （Na₂HPO₄·12H₂O），4.5 g 磷酸二氢钠 （NaH₂PO₄·2H₂O），80.0 g 氯化钠 （NaCl） 加入超纯水中，最终体积为 10 L。在室温 （RT） 下储存溶液。
2. 制备 200 mL 的 PBS-T:步骤 1.1 中的 200 mL PBS，用 100 μL 聚氧乙烯 （10） 辛基苯醚制备，终浓度为 0.05%（vol:vol）。储存在 RT。
3. 戴上手套和护目镜，在 10% 缓冲中性福尔马林溶液中制备 50 mL 15% 蔗糖:将 7.5 g 蔗糖添加到 10% 缓冲中性福尔马林溶液中（材料表），最终体积为 50 mL。储存在 RT.
   谨慎:吸入和/或皮肤/眼睛接触 10% 缓冲中性福尔马林溶液中的甲醛可能是危险的。请谨慎处理。
4. 制备 1.5 mL 200 单位/mL 鬼笔环肽-荧光染料偶联物储备液:鬼笔环肽-荧光染料偶联物（1 瓶中 300 单位，冻干固体、激发和发射波长分别为 581 nm 和 609 nm）悬浮在 1.5 mL 甲醇中。将溶液储存在 -20 °C 的黑暗中。
5. 制备 5 mg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐 （DAPI） 储备溶液:10 mg DAPI 在 2 mL N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中。将溶液储存在 -20 °C 的黑暗中。
6. 在 PBS 中制备 5% 牛血清白蛋白 （BSA）:0.5 g BSA、10 mL PBS。储存在 4 °C。
7. 使用钳子去除 18 号直针的斜面尖端，然后用钳子沿纵向捏住夹子的末端，让液体流过针腔（图 1A1）
   注意:该协议可以在此处暂停。

2. 动物解剖和空肠分离

1. 小鼠的灌注固定
   1. 戴手套并在通风良好的地方工作。
   2. 准备一个 100 mL 玻璃烧杯、10% 缓冲中性福尔马林溶液、手术工具（剪刀、镊子）、一个金属托盘、6-0 根尼龙切割缝合线、一根 18 号直针，一个 22 号翼针，一个 20 mL 注射器。
   3. 将 20 mL 10% 缓冲中性福尔马林溶液从玻璃烧杯中装入 20 mL 注射器中，并将 22 号翼形针头连接到出口。
   4. 通过在 50 mL 离心管中将 1 g 明胶粉添加到 20 mL PBS（最终 5% 明胶）中来制备液体明胶。在 RT 中浸泡 15 分钟后，在 50 °C 下在水浴中孵育 15 分钟，不要摇晃。
   5. 短暂涡旋并在 50 °C 下再孵育 15 分钟以完全溶解明胶。将试管留在 RT 直至使用。
   6. 通过颈椎脱位对成年小鼠实施安乐死。
   7. 将步骤 2.1.6 中的鼠标放在金属托盘上，并使用手术工具通过 ensiform 软骨在皮肤上做一个小切口。
   8. 用双手扩大切口，露出胸部和腹部区域。
   9. 打开腹膜，露出隔膜，然后打开两侧的隔膜。
   10. 沿两侧腋前线切开胸廓，然后在胸腺位置横向切开胸壁，露出心脏。
   11. 在右心房的耳廓上做一个小切口以排出血液，然后将 22 号翼针插入左心室的心尖。推动柱塞，用 10% 缓冲中性福尔马林溶液灌注组织。
   12. 暴露骨盆中的器官后，从肛门切开直肠末端，并通过切开肠系膜将肠道与身体分开。
   13. 为了分离空肠，在距离胃窦肛门侧 4 厘米处切开肠道。丢弃剩余小肠的肛门半部分。
   14. 将空肠夹成两半，以方便冲洗程序。将 20 mL 10% 缓冲中性福尔马林溶液装入 20 mL 注射器中，并将步骤 1.7 中制备的 18 号直针连接到出口。
   15. 从夹住的空肠的一端注入 10% 缓冲的中性福尔马林溶液，以冲洗出肠道内容物并固定肠腔表面（图 1A2）。
   16. 如步骤 2.1.15 中所述，通过注射 PBS 清洗肠腔。
   17. 按照步骤 2.1.15 中的说明将液体明胶冲洗到肠腔中，以用液体明胶代替 PBS。
   18. 使用 6-0 尼龙切割缝合线通过缝合结扎闭合夹住的空肠的一端，用液体明胶填充空肠，并通过缝合结扎闭合另一端（图 1A3）。
   19. 添加四个缝合结，以将香肠状空肠切片与低温模具的凹陷部分相匹配（图 1A4）。
       注意:对于具有 20 mm x 25 mm x 5 mm 凹陷截面的低温模具，最好使用 ~20 mm 的香肠状空肠截面。
   20. 将组织浸泡在 50 mL 15% 蔗糖和 10% 缓冲中性福尔马林溶液中，在 4 °C 下过夜><。 注意:这些步骤确保通过蔗糖进行冷冻保护，并通过福尔马林对明胶和组织进行蛋白质固定。福尔马林-糊化明胶在 RT 下不熔化，而 4 °C 下的非固定糊化明胶在 RT 下熔化。

3. 填充明胶的空肠组织的快速冷冻

1. 通过在缝合结处切割空肠，获得三个两端结扎的香肠状空肠片（图 1A4）。在低温模具中对齐香肠状块，以添加包埋化合物以制备冷冻组织标本。
2. 将冷冻模具置于用液氮冷却的异戊烷中。将低温模具储存在 -80 °C
   注意:该协议可以在此处暂停。

4. 使用自由浮动冷冻切片对簇状细胞进行免疫荧光

1. 冷冻切片
   1. 将低温恒温器室温度 （CT） 和物体温度 （OT） 设置为 -22 °C。将冷冻组织块放入低温恒温器室的低温模具中至少 15 分钟。
   2. 向 35 mm 培养皿中加入 3 mL PBS。
   3. 从冷冻模具中取出冷冻的组织块，然后用剃须刀片将块切成两半，露出空肠的横截面。将块的一半安装在卡盘（低温恒温器适配器）上，以用剃须刀片切割平面。
   4. 将充满明胶的空肠切成 30 μm 厚的切片。使用冷冻镊子轻轻地将切片转移到步骤 4.1.2 中制备的 35 毫米培养皿中（图 2B，右）。
2. 一抗的应用
   在
   1. 35 mm 培养皿中洗涤自由浮动的切片 3 次，每次 5 分钟，用 3 mL PBS-T 在往复摇床上轻轻摇动（约 36 次/分钟）。
   2. 制备抗原修复溶液:0.3 mL 抗原修复溶液浓缩液（材料表）溶于 2.7 mL 超纯水中。将 3 mL 抗原修复溶液添加到包含自由浮动切片的 35 mm 培养皿中。
   3. 盖上盖子，用一条乙烯基胶带密封培养皿和盖子之间的间隙，并在 50 °C 下在杂交培养箱中孵育 3 小时而不摇晃。
   4. 从培养箱中取出培养皿，在 RT 下冷却 20 分钟。撕下乙烯基胶带后，用 3 mL PBS-T 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，并轻轻摇晃。
   5. 吸出 PBS-T 并在切片上加入 5 滴封闭溶液（材料表）。在 RT 下孵育 5 分钟，轻轻摇晃。
   6. 制备一抗溶液:495 μL 5% BSA 的 PBS 溶液和 5 μL 磷酸化 Y1798 girdin （pY1798） 抗体（材料表）。在切片上添加 500 μL 一抗溶液（无需去除封闭溶液）。
   7. 将培养皿置于加湿的培养室中，并在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜。
      注意:过夜孵育可延长至最多三个晚上。
3. 二抗的应用
   1. 在 3 mL PBS-T 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，轻轻摇晃。
   2. 准备稀释的 DAPI 储备溶液:2 μL DAPI 储备溶液（步骤 1.5），998 μL PBS。
   3. 制备二抗溶液:476 μL 5% BSA 的 PBS 溶液、10.5 μL 稀释的 DAPI 溶液、12.5 μL 鬼笔环肽-荧光染料偶联物储备液、1 μL 山羊抗兔 IgG-荧光染料偶联物（波长:激发 496 nm，发射 520 nm）。
   4. 吸出 PBS-T 后，涂上二抗溶液，并在 RT 的遮光孵育室中孵育 30 分钟，同时轻轻摇晃。
   5. 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，用 3 mL PBS-T 洗涤并轻轻摇晃。
   6. 最后一次洗涤后，去除 PBS-T，用 3 mL 不含聚氧乙烯 （10） 辛基苯醚的 PBS 替换。将培养皿转移到立体显微镜上。
   7. 将 200 μL PBS 放入 MAS 涂层白色载玻片中心的液滴中，并使用 P200 移液管吸头将一个空肠切片从培养皿转移到液滴中。
   8. 在立体显微镜下调整切片对齐后，吸出切片周围所有剩余的 PBS。
   9. 加入 20 μL 水性封固剂，并在培养基上放置 20 x 20 mm 盖玻片。
   10. 立即用二甲苯基封固剂密封盖玻片边缘。将载玻片放在木制地图上，让二甲苯基封固剂在 RT 下固化 2 - 3 小时。
       注意:该协议可以在此处暂停。基于二甲苯的封固剂凝固后，载玻片可以在 RT 的遮光载玻片盒中储存 2 - 3 周。

5. 共聚焦显微镜

1. 将浸油放在共聚焦显微镜的 63X 物镜上。向下转动盖玻片，将载玻片放在载物台上。
2. 数字化在激光波长 405、488 和 555 nm 处采集的 TC 图像，并以 tiff 格式 （.tiff） 保存图像。
   注意:选择适合荧光染料的检测滤光片组（即最大激发/发射波长:358/461 nm、490/525 和 590/617）。

Results

图 1:用于冷冻切片形态保存的空肠切片的明胶填充
（A） 用明胶填充小鼠空肠的程序照片。（A1） 去除 18 号直针的斜面尖端，以避免刺穿肠壁。 （A2） 将缓冲的中性福尔马林溶液 （10%） 注射到夹住的空肠的一端，以冲洗肠内容物并固定肠腔表面。（A3） 夹住的空肠装满液体明胶，两端用 6-0 尼龙缝合线（黑色箭头）结扎。 （A4） 在先前存在的缝合结（黑色箭头）之间放置另外四个缝合结（白色箭头）产生了三个较短的缝合结。然后将组织在两个指示位置（白色箭头）分成三个香肠状的碎片。 ...

Materials