来源：Mizutani, Y. 等，利用抗磷酸化Girdin抗体在小鼠空肠游离冰冻切片中可视化肠道簇细胞。J. Vis. Exp. (2018)
本视频展示了一种基于免疫荧光的方法，用于在游离的小鼠空肠冷冻切片中观察肠杯状细胞。在肠绒毛内，管腔顶端的绿色荧光与延伸的红色根状结构共定位，表明存在杯状细胞。
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方法文章
一种基于免疫荧光的空肠冷冻切片中簇细胞可视化方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 准备工作
- 配制 10 L 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 32.27 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、4.5 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和 80.0 g 氯化钠（NaCl）加入超纯水中，定容至 10 L。溶液于室温（RT）保存。
- 配制 200 mL PBS-T：取步骤 1.1 中的 PBS 200 mL，加入 100 µL 聚氧乙烯（10）辛基苯基醚，终浓度为 0.05%（体积比）。于室温保存。
- 佩戴手套和护目镜，配制 50 mL 15% 蔗糖的 10% 缓冲中性甲醛溶液：将 7.5 g 蔗糖加入 10% 缓冲中性甲醛溶液（材料表）中，定容至 50 mL。溶液于室温保存。
注意：吸入或皮肤/眼部接触 10% 缓冲中性甲醛溶液中的甲醛可能具有危害性。操作时需谨慎。 - 配制 1.5 mL 浓度为 200 单位/mL 的鬼笔环肽-荧光染料偶联物储备液：将鬼笔环肽-荧光染料偶联物（每瓶 300 单位，冻干粉末，激发波长和发射波长分别为 ....
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结果
图1：小肠节段经明胶填充以实现冷冻切片形态学的保存
(A) 小鼠空肠腔内注射明胶操作步骤的示意图。(A1) 切除18号直针的斜面针尖，以避免刺穿肠壁。(A2) 从夹闭的空肠一端注入10%中性缓冲福尔马林溶液，以冲洗肠内容物并固定肠腔表面。(A3) 将液态明胶注入夹闭的空肠段，并用6-0尼龙缝线结扎两端 （黑色箭头）。(A4) 在原有缝线结扎点之间 （黑色箭头） 再添加四个缝线结 （白色箭头）.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Slc:DDY 6周龄雌性小鼠 | Chubu Kagaku Shizai | 不适用 | |
| 十二水合磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O) | Wako | 196-02835 | |
| 二水合磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O) | Wako | 199-02825 | |
| 氯化钠 (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| 曲拉通 X-100，聚氧乙烯(10)辛基苯基醚 | Katayama Chemical | 不适用 | |
| 蔗糖 | Wako | 190-00013 | |
| 10% 缓冲中性福尔马林溶液 | Muto Chemical | 20215 | 步骤 1.3. |
| 鬼笔环肽-荧光染料偶联物，Alexa Fluor 594 鬼笔环肽 | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| 甲醇 | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9647-10G | |
| 18号不锈钢直针 | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0，60 cm 尼龙切割缝线，Crownjun | Kono Seisakusho | 不适用 | |
| 22号带翼针头 | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO 注射器 | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL 离心管 | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki 离心管 | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Star | RSV-MTT1.5 | |
| 明胶粉末，Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| 冷冻组织标本包埋剂，O.C.T. Compound 118 mL 12 件装 | Sakura FineTech | 4583 | |
| 冷冻模具，CRYO DISH No. 3，125 件装，孔尺寸 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| 异戊烷 | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon 细胞培养皿 35 x 10 mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| 抗原修复液浓缩液，Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | 步骤 4.2.2 中的抗原修复液浓缩液 |
| 蛋白封闭剂 | Dako | X0909 | 步骤 4.2.5 中的封闭溶液 |
| 磷酸化-Y1798 girdin (pY1798) 抗体 | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | 步骤 4.2.6 中的磷酸化-Y1798 girdin 抗体 |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| 水性封片剂，Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| 盖玻片，Matsunami 显微盖玻片 22 x 22 mm 100 片装，厚度 No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New，基于二甲苯的显微镜封片剂 | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS 涂层白片载玻片 | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| 木质标本盒 KO 型 | Shoei Work's | 99-40007 | |
| 浸油 518 F 无荧光 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| 移液器，Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| 超纯水制备系统 | Advantec | GS-590 | |
| 塑料手套，Star 丁腈手套 | Star | RSU-NGVM | |
| 冷冻切片机 | Leica Microsystems | CM1950 | |
| 超低温冰箱，SANYO 超低温 | Sanyo | MDF-382 | |
| 展示用冰箱 | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| 水浴锅，Thermominder SDminiN（用于在 50 °C 溶解明胶） | Taitec | 0068750-000 | |
| 杂交孵育器（用于 50 °C 抗原修复） | Taitec | HB-100 | |
| 免疫染色孵育盒 | Cosmo Bio | 10DO | |
| 免疫组织化学用往复摇床（室温） | Taitec | NR-1 | |
| 免疫组织化学用往复摇床（4 °C） | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| 体视显微镜（用于组织操作） | Olympus | SZ61 | |
| 体视显微镜（用于图 1B） | Leica Microsystems | M165FC | |
| 荧光显微镜（用于图 3） | Nikon | E800 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM700 |
