一种体内追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的技术

摘要

来源：Espinosa-Cotton, M.，等。利用荧光素酶转导的人T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频展示了一种在小鼠模型中追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的方法。将经荧光素酶转导的效应T细胞注射到皮下移植肿瘤异种移植物的小鼠体内。随后引入双特异性抗体，使其同时结合T细胞和肿瘤细胞。通过生物发光成像追踪T细胞的定位，信号强度反映T细胞浸润肿瘤的程度。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 用荧光素酶转染293T细胞并收集病毒上清液

1. 293T 细胞的培养
   1. 在 1 升 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入以下成分以配制培养液：110 mL 热灭活胎牛血清（FBS）、11 mL 青霉素-链霉素溶液。
   2. 将 5 × 10⁶ 个 293T 细胞解冻后，转移至含有上述配制培养液的 T175 培养瓶中。
   3. 每 3 天按 1:10 的比例传代 293T 细胞，持续 6 天。细胞融合度不得超过 90%。
2. 293T 细胞的转染
   注意：以下试剂用量是针对一个 T175 培养瓶的 293T 细胞转染计算的。若需转导更多培养瓶，请相应调整用量。
   1. 用移液器将 1.5 mL 培养液分别加入两个 50 mL 离心管中。向其中一管加入 10 µg VSV-G 质粒、20 µg Gag/pol 质粒和 20 µg 红色甲虫荧光素酶（CBR-TDR）质粒，并混匀；向另一管加入 100 µL DNA 体外 转染试剂，并混匀。两管均在室温（RT）孵育 5 分钟。
      注意：本研究中所用的所有质粒均由 Vladimir Ponomarev 博士提供。
   2. 将含有 DNA 体外 转染试剂的培养液逐滴加入含 DNA 质粒的管中（约 30 秒内加完），并用移液器轻轻混匀。室温孵育 20 分钟。
   3. 在上述 20 分钟孵育期间，加入 5–10 mL 0.05% 胰蛋白酶使 293T 细胞脱落。待细胞脱落后，加入 10 mL 培养液，于 800 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 培养液中。
   4. 将含有 DNA 体外 转染试剂与 DNA 质粒的培养液加入 293T 细胞中，于 37 °C 孵育 30 分钟。
   5. 转移至 T175 培养瓶，并加入 18 mL 培养液。于 37 °C 过夜孵育。
   6. 次日，用玻璃移液管小心吸除培养液，避免细胞脱落。更换为 18 mL 新鲜培养液。在 37 °C 培养箱中继续过夜孵育。
3. 收集病毒上清液
   1. 用移液器收集病毒上清液并置于冰上。于 800 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞及碎片。
      注意：若细胞沉淀量较大，可能是收集上清液时细胞从培养瓶中被扰动脱落所致。这些细胞可重新接种于新的培养瓶中，并加入新鲜培养液继续培养。
   2. 使用 0.22 µm 滤器过滤病毒上清液。
   3. 立即使用病毒上清液。如需短期保存，可置于冰上或 4 °C 不超过 24 小时；如需长期保存，应于 -80 °C 冻存。

2. 利用荧光素酶扩增并转导活化的人T细胞

1. 体外激活人 T 细胞 in vitro
   1. 向无菌 15 mL 离心管中加入含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）10 mL，加入磁珠（每两个 T 细胞加一个磁珠），置于磁力架上 2 分钟，吸除 PBS。
   2. 按步骤 1.1.1 所述配制培养基，然后加入 IL-2 至终浓度为 30 IU/mL，并加入洗涤后的磁珠。每激活两百万个 T 细胞，需配制 2.5 mL 培养基。
   3. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色对 T 细胞（新鲜纯化或先前纯化、冻存、解冻并洗涤的细胞）进行计数。将 T 细胞加入步骤 2.1.2 配制的培养基中，轻轻颠倒混匀。T 细胞将根据来源及细胞总体健康状况扩增至少 20 倍。通过计算治疗小鼠所需细胞数量并除以 20，确定需激活的 T 细胞数量。此处基于预实验采用每只小鼠 20 × 10⁶ 个 T 细胞。
   4. 在 24 孔组织培养板的每个孔中加入含两百万个 T 细胞、磁珠和（白细胞介素 2）IL-2 的 2.5 mL 培养基。于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中培养。
   5. 在接下来的 3 天内每天使用 20 倍显微镜观察 T 细胞，以确定转导荧光素酶的时机。当细胞聚集成团并耗尽培养基，使其颜色由红/粉变为浅橙色时，表明细胞已准备就绪。
2. 纤连蛋白包被板的制备
   注意： 转导过程中使用纤连蛋白包被培养板，因其可增强基因转导效率。
   1. 向未经处理的 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 含 20 µg/mL 纤连蛋白的 PBS 溶液。室温孵育 2 小时或 37 °C 孵育 1 小时。每转导两百万个 T 细胞需一个纤连蛋白包被孔。
   2. 吸除纤连蛋白溶液，注意勿刮伤孔底。
   3. 向 6 孔板每孔加入 3 mL 含 2% BSA 的 PBS 溶液（经无菌过滤）。室温孵育 30 分钟。
3. 离心转导（Spinoculation）
   1. 吸除 BSA 溶液，注意勿刮伤孔底。
   2. 用每孔 3 mL PBS 洗涤一次。可继续使用原 PBS 或更换新鲜 PBS，并将板盖好后于 4 °C 过夜孵育。
   3. 向每孔加入 2 mL CBR-TDR 荧光素酶病毒上清液（于步骤 1.3 收集）。
   4. 于 32 °C 以 1,240 × g 离心 90 分钟。
4. 转导
   1. 对 T 细胞进行计数。
   2. 吸除病毒上清液，注意勿刮伤孔底。
   3. 在含 30 IU/mL 人 IL-2 的 6 mL DMEM 培养基中，每孔接种两百万个 T 细胞。
   4. 每日观察 T 细胞状态。当细胞接近汇合时即准备扩增，通常在 2 天后达到此状态。
   5. 当细胞接近汇合时，用移液器轻轻吹打使细胞脱离孔底，并将每孔细胞转移至单独的 T75 培养瓶中。每瓶加入 9 mL 培养基，使总体积达 15 mL。
   6. 次日再加入 15 mL 新鲜培养基。加入培养基后的第二天，细胞即可用于注射小鼠。通过流式细胞术检测转导效率（荧光素酶载体包含一个可在 PE 通道检测到的 TD 番茄荧光蛋白）。

3. 免疫缺陷小鼠中转导荧光素酶的T细胞的移植

1. 制备并计数用于注射的T细胞。
   1. 从培养瓶中取出T细胞并进行计数。当细胞扩增至20至30倍时即可用于注射，通常在激活后的第7天达到此状态。
   2. 将T细胞在800 x g条件下离心 g 孵育5分钟。用2 mL培养基重悬，并使用磁力架去除磁珠。
   3. 对于需要将T细胞与双特异性抗体分别注射的实验，计数T细胞并重悬于培养基中，使最终浓度为每100 µL培养基含2000万T细胞。跳至步骤3.2。对于使用 离体 武装的T细胞（EATs），跳至步骤3.1.4。
   4. 对于使用以下方法的实验 离体 武装T细胞后，对T细胞进行计数，并按每组每只小鼠2000万个细胞的量分装至各自的1.5 mL离心管中。例如，若共有三组，每组五只小鼠，则准备三个1.5 mL离心管，每管含1亿个T细胞。
   5. 将1.5 mL离心管在800 x g条件下离心 g 孵育5分钟。小心移除上清液，避免扰动T细胞沉淀。用不超过50 µL含双特异性抗体的培养基重悬细胞。室温孵育30分钟。
      注意： 本研究实验所用的为实验室制备的专利性IgG-[L]-scFv T细胞结合型双特异性抗体。用于T细胞武装时，每20 × 10⁶个细胞使用5 µg抗体。⁶ T细胞。也可使用市售的双特异性抗体。
   6. 加入 1,450 µL 培养基洗涤各管，以去除过量抗体。800 x g 孵育5分钟后，小心吸除培养基，并将细胞重悬于培养基中，浓度为每100 µL含2000万武装T细胞。
2. 注射与移植至小鼠体内
   1. 将小鼠置于麻醉舱内，以1 L/min的氧气流速供给3.5%（v/v）吸入用异氟烷进行麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明其已完全麻醉。
      注意： 在整个操作过程中提供热支持。
   2. 使用26 G针头，每只小鼠经眶后静脉注射2000万T细胞，体积为100 µL培养基。
   3. 皮下注射 1,000 U 重组 IL-2 以支持 T 细胞存活 体内.
   4. 将双特异性抗体经眶后注射（注入未用于T细胞注射的眼部）或腹腔注射。让小鼠从麻醉中恢复并放回笼中。
      ​注意： 同样，本实验使用了实验室自主研发的专有抗体，但也可使用市售抗体替代。在本研究的实验中，每只小鼠每次给药剂量为 0.3–10 µg 抗体，每周给药两次，持续 3–4 周。

4. 体内 成像检测移植了荧光素酶转导T细胞的小鼠

注意：此步骤应在成像当天进行，而该日期不一定与将T细胞和/或抗体给予小鼠的日期相同。通常，我们在将荧光素酶转导的T细胞给予小鼠后24小时进行成像。

1. D-荧光素的制备
   1. 将1 g D-荧光素溶解于33.3 mL无菌PBS中（终浓度：30 mg/mL）。
   2. 将溶解后的D-荧光素分装至33个1.5 mL微量离心管中，每管1 mL，并将离心管保存于-20 °C。
   3. 成像当天，根据待成像动物数量解冻足够量的30 mg/mL D-荧光素溶液。每管可供10只动物使用。
      注意：使用后应将剩余的D-荧光素重新冷冻。D-荧光素在至少五次冻融循环中保持稳定。
2. 向小鼠给药D-荧光素
   注意：在向小鼠注射D-荧光素前，打开成像软件并初始化系统。相机可能需要数分钟时间冷却，此过程应在小鼠注射D-荧光素前完成，以确保在底物给药后5分钟内开始成像。
   1. 将最多五只小鼠置于麻醉室中，使用1 L/min氧气携带3.5%（v/v）异氟烷进行吸入麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明已完全麻醉。
   2. 小鼠完全麻醉后，使用26 G针头经眶后静脉注射每只小鼠100 µL 30 mg/mL D-荧光素溶液（每只小鼠3 mg）。在对下一组小鼠给药前，先完成本组小鼠的成像。在对前一组小鼠进行成像的同时，将下一组小鼠放入异氟烷麻醉室中进行麻醉。
3. 成像荧光素酶转导的T细胞
   1. 将麻醉后的小鼠转移至成像仪的避光暗室中，并持续以0.5 L/min流速供给3%异氟烷。将小鼠侧卧放置，使携带异种移植瘤的一侧腹面朝上对准相机镜头。另取仰卧位拍摄一组图像，用于评估T细胞在肺部的分布情况。
   2. 在 采集控制面板中，选择 生物发光、 拍照和 叠加模式。将曝光时间设为自动，binning设为中等，F值设为1，开始采集图像。获取第一张图像后，将后续图像的曝光时间设置为与第一张图像自动计算出的时间一致，以便直接比较不同图像。为确定在不引起像素饱和的情况下获得最强信号的最佳曝光时间，可尝试采集多个不同曝光时间的图像。
   3. 成像结束后，将小鼠撤离异氟烷，放回笼中，并观察直至其清醒并能自主活动。
   4. 重复步骤4.2.1的操作，直至所有组别均完成成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
293T 细胞	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 磁珠	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-荧光素钾盐	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
体外 DNA 转染试剂（polyjet）	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol 质粒	Addgene	14887
GFP 质粒	Addgene	11150-DNA.cg
青霉素-链霉素	Gibco (ThermoFisher)	15140122
重组人 IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
胰蛋白酶	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G 质粒	Addgene	8454