一种双标记免疫荧光技术，用于可视化受感染细胞中的宿主和病原体蛋白

摘要

来源:Gachet-Castro， C. et al.， 使用来自同一物种的抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用。J. Vis. Exp.（2021 年）

该视频展示了使用同一物种中产生的两种不同一抗进行双标记免疫染色，这些一抗特异性结合寄生虫和宿主蛋白。此外，靶向这些一抗的标记二抗允许对宿主和寄生虫蛋白进行清晰的可视化，从而促进宿主-病原体相互作用的研究。

方案

1. 细胞和寄生虫培养物

在
1. 25 cm 2 细胞培养瓶中培养来自美国典型培养物保藏中心 （CCL-7） 的 LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，该培养瓶中含有补充有 10% 热灭活 FBS（胎牛血清）和抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的 25 cm² 细胞培养瓶，在 37 °C 下在 5% 二氧化碳 （CO₂） 中。
2. 根据先前的方案，用克氏锥虫（Y 菌株）感染 LLC-MK2 细胞。
3. 将 LLC-MK2 感染细胞的上清液 （5 mL） 收集在 15 mL 细胞培养锥形离心管中，并以 500 x g 离心 10 分钟，并在 22 °C 下离心以降低细胞碎片。将试管在 37 °C 下放置 10 分钟，让锥鞭毛体游到上清液中。
4. 将上清液收集到新的锥形管中，并在 22 °C 下以 2500 x g 离心 15 分钟。弃去上清液，将含有寄生虫的沉淀重悬于完整的 RPMI 培养基中，通过在 Neubauer 腔室中计数细胞来确定细胞密度。

2. 对照免疫荧光实验方案

注意:固定后，可以在 4 °C 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.2） 中将含有盖玻片的板储存一周。为了储存，重要的是细胞没有经过透化步骤。

1. 将 LLC-MK2 细胞 （2 x 10⁴） 沉放在含有紫外线 （UV） 灭菌圆形盖玻片的 RPMI 培养基中 24 孔板中 16 小时。
2. 对于感染的细胞，按比例向每个孔中加入含有克氏锥虫（第 1.4 项）的上清液（感染复数，MOI 10:1），并放置 6 小时感染。用 PBS 溶液洗涤含有感染和未感染细胞的盖玻片 5 次，并在室温 （RT） 下用 2% 多聚甲醛在 1x PBS （pH 7.2） 中固定 10 分钟。
3. 用 1x PBS （pH 7.2） 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
4. 在室温下用 0.2% IGEPAL CA-630（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）在 1x PBS（PH 7.2）中透化盖玻片 10 分钟。
5. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
6. 将盖玻片在 RT 下与封闭溶液（2% 牛血清白蛋白，BSA 在 1x PBS 中，pH 7.2）孵育 30 分钟。
在
7. 室温下用小鼠单克隆抗 hnRNPA1（抗异质核糖核蛋白-A1）（稀释度 1:200）或小鼠多克隆抗 TcFAZ（抗克氏锥虫鞭毛附着区蛋白）（稀释度 1:100）抗体孵育盖玻片 30 分钟在封闭溶液中稀释。
8. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
将
9. 盖玻片在室温下与与 Alexa Fluor 488 （1:600） 偶联的山羊抗小鼠 IgG F （ab'）2 （H+L） 以及与 Alexa 594 （1:300） 偶联的鬼笔环肽一起孵育 30 分钟，以对在封闭溶液中稀释的宿主细胞中的肌动蛋白丝 （F-肌动蛋白） 进行染色。
10. 用 1x PBS （pH 7.2） 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
11. 将少量 ProLong Gold 抗淬灭封片剂和 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 培养基涂在玻片表面。
12. 使用镊子轻轻倾斜封固剂中的盖玻片，以防止形成气泡。干燥后，如果需要，密封盖玻片。

3. 使用在同一宿主中产生的单克隆和多克隆抗体的双标记免疫荧光方案

1. 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
将
2. 含有感染和未感染细胞的盖玻片与内部小鼠多克隆抗 TcFAZ 抗体 （1:100） 在封闭溶液中稀释，在 RT 下孵育 30 分钟。
3. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
将
4. 盖玻片与在封闭溶液中稀释的 Alexa Fluor 647 （1:600） 偶联的山羊抗小鼠 IgG F （ab'）2 （H+L） 在 RT 下孵育 30 分钟。
5. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
6. 在 RT 下，使用在封闭溶液中稀释 （0.12 mg/mL） 的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG （H+L） 30 分钟进行第二个封闭步骤。
7. 用 1x PBS （pH 7.2） 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。然后在室温下与小鼠单克隆抗 hnRNP A1 IgG2b 抗体 （1:200） 孵育 30 分钟。
8. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
9. 将盖玻片与与 Alexa Fluor 488 （1:600） 偶联的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体和与在封闭溶液中稀释的 Alexa 594 偶联的鬼笔环肽 （1:300） 孵育 30 分钟。
10. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
11. 重复上述步骤 2.8 到 2.10。

材料