一种双标记免疫荧光技术用于可视化感染细胞中的宿主与病原体蛋白

摘要

来源：Gachet-Castro, C. 等，利用同一物种抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了使用同一种属来源的两种不同一抗进行双重标记免疫染色，这两种一抗可特异性结合寄生虫和宿主的蛋白质。此外，通过使用针对这些一抗的标记二抗，可清晰区分宿主和寄生虫蛋白的信号，从而促进宿主-病原体相互作用的研究。

方案

1. 细胞与寄生虫培养

1. 在美国典型培养物保藏中心（CCL-7）获取LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，在含有RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基的25 cm² 细胞培养瓶中培养，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下培养。
2. 根据先前的实验方案，用 Trypanosoma cruzi （Y株）感染LLC-MK2细胞。
3. 收集感染后的LLC-MK2细胞上清液（5 mL）至15 mL细胞培养锥形离心管中，在22 °C条件下以500 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。将离心管置于37 °C环境中静置10分钟，使上清液中的上鞭毛体自由游动至液体上层。
4. 将上清液转移至新的锥形管中，在22 °C条件下以2500 × g离心15分钟。弃去上清液，将含有寄生虫的沉淀物重悬于完全RPMI培养基中，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数，以确定细胞密度。

2. 对照免疫荧光实验方案

注意：固定后，含有盖玻片的培养板可在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.2）中于 4 °C 保存一周。保存时需注意，细胞不应经过通透化步骤。

1. 将LLC-MK2细胞（2 × 10⁴）接种于24孔板中，每孔含经紫外（UV）灭菌的圆形盖玻片，并加入RPMI培养基，培养16小时。
2. 对于感染组细胞，按比例（感染复数，MOI 10:1）向每孔加入含有 T. cruzi （见步骤1.4）的上清液，感染6小时。用PBS溶液洗涤含感染和未感染细胞的盖玻片5次，随后用含2%多聚甲醛的1×PBS（pH 7.2）在室温（RT）下固定10分钟。
3. 用1×PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
4. 用含0.2% IGEPAL CA-630（辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）的1×PBS（pH 7.2）在室温下处理盖玻片10分钟，进行透化。
5. 用1×PBS洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
6. 将盖玻片置于封闭液（含2%牛血清白蛋白，BSA的1×PBS，pH 7.2）中，在室温下孵育30分钟。
7. 将盖玻片在室温下孵育30分钟，分别加入用封闭液稀释的小鼠单克隆抗hnRNPA1抗体（抗异质性核糖核蛋白A1，1:200稀释）或小鼠多克隆抗TcFAZ抗体（抗Trypanosoma cruzi鞭毛附着区蛋白，1:100稀释）。
8. 用1×PBS洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗涤3次。
9. 将盖玻片在室温下孵育30分钟，加入用封闭液稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG F(ab')2（H+L）二抗（1:600）以及Alexa 594标记的鬼笔环肽（1:300），用于染色宿主细胞中的肌动蛋白丝（F-actin）。
10. 用1×PBS（pH 7.2）洗涤3次，每次5分钟。
11. 在载玻片表面滴加少量含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂。
12. 用镊子轻轻倾斜盖玻片，使其进入封片剂中，避免产生气泡。待其干燥后，可根据需要对盖玻片进行封固。

3. 使用同一宿主产生的单克隆与多克隆抗体进行双重标记免疫荧光实验的方案

1. 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
2. 将含有感染和未感染细胞的盖玻片与实验室自制的小鼠多克隆抗 TcFAZ 抗体（1:100）在封闭液中稀释后，在室温下孵育 30 分钟。
3. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
4. 在室温下，将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG F(ab')2 (H+L) 抗体（1:600）孵育 30 分钟。
5. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
6. 在室温下，用封闭液稀释的 AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L)（0.12 mg/mL）进行第二次封闭步骤，孵育 30 分钟。
7. 用 1× PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟；然后在室温下与小鼠单克隆抗 hnRNP A1 IgG2b 抗体（1:200）孵育 30 分钟。
8. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
9. 将盖玻片与用封闭液稀释的 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体（1:600）以及 Alexa 594 标记的鬼笔环肽（1:300）在室温下共同孵育 30 分钟。
10. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
11. 重复上述步骤 2.8 至 2.10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体	Life technologies, USA	A21141	山羊抗小鼠
AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	抗小鼠抗体
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A11017	山羊抗小鼠
Alexa Fluor 594 IgG1 抗体	Life technologies, USA	A21125	山羊抗小鼠
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A21237	山羊抗小鼠
抗 hnRNPA1 抗体 IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	小鼠抗体
抗 TcFAZ (T. cruzi FAZ 蛋白) 抗体	本实验室	自制品	小鼠抗体
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	白蛋白蛋白
去垢剂 Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	非离子型去垢剂
胎牛血清 (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	血清
青霉素-链霉素	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	抗生素
鬼笔环肽 Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	肌动蛋白标记物
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life technologies, USA	P36935	封片介质试剂
RPMI 1640 1X 含 L-谷氨酰胺	Corning, USA	10-040-CV	细胞培养基
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	生物试剂