一种双标记免疫荧光技术用于可视化感染细胞中的宿主与病原体蛋白

摘要

来源：Gachet-Castro, C. 等，利用同一物种抗体进行双重标记免疫荧光研究宿主-病原体相互作用 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了使用同一种属来源的两种不同一抗进行双重标记免疫染色，这两种一抗可特异性结合寄生虫和宿主的蛋白质。此外，通过使用针对这些一抗的标记二抗，可清晰区分宿主和寄生虫蛋白的信号，从而促进宿主-病原体相互作用的研究。

方案

1. 细胞与寄生虫培养

1. 在美国典型培养物保藏中心（CCL-7）获取LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，在含有RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基的25 cm² 细胞培养瓶中培养，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下培养。
2. 根据先前的实验方案，用 Trypanosoma cruzi （Y株）感染LLC-MK2细胞。
3. 收集感染后的LLC-MK2细胞上清液（5 mL）至15 mL细胞培养锥形离心管中，在22 °C条件下以500 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。将离心管置于37 °C环境中静置10分钟，使上清液中的上鞭毛体自由游动至液体上层。
4. 将上清液转移至新的锥形管中，在22 °C条件下以2500 × g离心15分钟。弃去上清液，将含有寄生虫的沉淀物重悬于完全RPMI培养基中，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数，以确定细胞密度。

2. 对照免疫荧光实验方案

注意：固定....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体	Life technologies, USA	A21141	山羊抗小鼠
AffiniPure 兔抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	抗小鼠抗体
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A11017	山羊抗小鼠
Alexa Fluor 594 IgG1 抗体	Life technologies, USA	A21125	山羊抗小鼠
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体	Life technologies, USA	A21237	山羊抗小鼠
抗 hnRNPA1 抗体 IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	小鼠抗体
抗 TcFAZ (T. cruzi FAZ 蛋白) 抗体	本实验室	自制品	小鼠抗体
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	白蛋白蛋白
去垢剂 Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	非离子型去垢剂
胎牛血清 (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	血清
青霉素-链霉素	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	抗生素
鬼笔环肽 Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	肌动蛋白标记物
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life technologies, USA	P36935	封片介质试剂
RPMI 1640 1X 含 L-谷氨酰胺	Corning, USA	10-040-CV	细胞培养基
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	生物试剂