一种用于纯化单克隆抗体的亲和层析技术

摘要

来源：Elgundi, Z.，等。治疗性抗体的实验室规模生产与纯化。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种从抗体生产细胞培养所获得的培养上清液中纯化单克隆抗体的技术。该过程采用交联琼脂糖珠基质，其上偶联了蛋白A，可将上清液中的抗体固定在琼脂糖珠上，从而有效分离杂质。通过加入低pH的洗脱缓冲液，可削弱蛋白A与抗体之间的相互作用，便于收集含抗体的组分。

方案

1. 使用自动化快速蛋白液相色谱（FPLC）系统通过亲和层析法纯化抗体

注意：以下步骤通常适用于大多数自动化系统。纯化可在室温或 4 °C 下进行（如果 FPLC 系统置于低温房间内）。可通过一系列预实验确定最佳纯化条件，包括合适的层析柱基质、结合缓冲液、洗脱缓冲液和 pH 值，以确保从条件培养基中最大程度回收纯化的抗体（参见结果部分）。最佳条件取决于待纯化的抗体或蛋白质。实验在自动化 FPLC 系统上进行，使用 5 ml Protein A 层析柱，并在室温下完成纯化。

1. 使用超纯水配制以下缓冲液，并调节至推荐的 pH 值，然后通过 0.22 µm 滤膜过滤。
   1. 通过混合以下成分配制 1 L 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（结合缓冲液）：0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M Na₂HPO₄ 和 0.001 M KH₂PO₄。必要时在过滤缓冲液前调节 pH。
   2. 配制 500 ml 0.1 M 甘氨酸-盐酸 pH 2.7（洗脱缓冲液）。在过滤缓冲液前调节 pH。
   3. 配制 50 ml 1 M Tris pH 9.0（中和缓冲液）。
2. 确保所有系统电源和与计算机的通信连....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，pH 7.4，100 ml	09-2051-100	Astral Scientific
HiTrap Protein A 高性能柱，1 x 5 ml	GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Healthcare	自动化FPLC系统，可包含P-960样品泵和Frac-920组分收集器。
甘氨酸-盐酸（Glycine-HCl）	G2879	Sigma-Aldrich
柠檬酸一水合物	BIOC2123	Astral Scientific
柠檬酸钠，三水合二钠盐	BIOCB0035	Astral Scientific
1 M Tris-HCl 溶液，pH 9.0	BIOSD8146	Astral Scientific
Amicon Ultra 离心滤膜（30 MWCO）	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	用于缓冲液置换和浓缩纯化后的蛋白质。
Pierce 二辛可宁酸（BCA）检测试剂盒	23227	Thermo Fisher Scientific
BLItz 系统	45-5000	fortéBIO	用于生物膜层干涉技术（BLI）测量的仪器。
Protein A 生物传感器	18-5010	fortéBIO