一种用于纯化单克隆抗体的亲和层析技术

摘要

来源：Elgundi, Z.，等。治疗性抗体的实验室规模生产与纯化。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了一种从抗体生产细胞培养所获得的培养上清液中纯化单克隆抗体的技术。该过程采用交联琼脂糖珠基质，其上偶联了蛋白A，可将上清液中的抗体固定在琼脂糖珠上，从而有效分离杂质。通过加入低pH的洗脱缓冲液，可削弱蛋白A与抗体之间的相互作用，便于收集含抗体的组分。

方案

1. 使用自动化快速蛋白液相色谱（FPLC）系统通过亲和层析法纯化抗体

注意：以下步骤通常适用于大多数自动化系统。纯化可在室温或 4 °C 下进行（如果 FPLC 系统置于低温房间内）。可通过一系列预实验确定最佳纯化条件，包括合适的层析柱基质、结合缓冲液、洗脱缓冲液和 pH 值，以确保从条件培养基中最大程度回收纯化的抗体（参见结果部分）。最佳条件取决于待纯化的抗体或蛋白质。实验在自动化 FPLC 系统上进行，使用 5 ml Protein A 层析柱，并在室温下完成纯化。

1. 使用超纯水配制以下缓冲液，并调节至推荐的 pH 值，然后通过 0.22 µm 滤膜过滤。
   1. 通过混合以下成分配制 1 L 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（结合缓冲液）：0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M Na₂HPO₄ 和 0.001 M KH₂PO₄。必要时在过滤缓冲液前调节 pH。
   2. 配制 500 ml 0.1 M 甘氨酸-盐酸 pH 2.7（洗脱缓冲液）。在过滤缓冲液前调节 pH。
   3. 配制 50 ml 1 M Tris pH 9.0（中和缓冲液）。
2. 确保所有系统电源和与计算机的通信连接均已正确连接。设备应在软件的“系统控制”模块中可见。确保紫外检测器设定在 280 nm 波长。可选：若已连接并计划使用 pH 计，则对其进行校准。
3. 将 A、B 和样品泵的进样管浸入超纯水中以清洗系统。如果管路中存在气泡或怀疑系统中有空气，使用注射器对泵进行排气。通过系统控制器手动操作或采用自动化方法用水清洗系统。观察压力、电导率、UV280 谱线和 pH 值是否稳定，并确保压力未超过色谱柱制造商规定的最大限值。
   注意：异常情况可能表明系统中存在空气或堵塞，应在继续操作前予以排除。
4. 在系统控制器模块中，通过泵 A 手动启动流速为 1 ml/min，选择加载（旁路样品环）或注入（通过样品环）模式，开始连接色谱柱。断开色谱柱入口处的系统管路，并移除连接在色谱柱入口的堵头。
   1. 让水从系统管路逐滴流到色谱柱顶部，然后将系统管路连接至色谱柱。确保色谱柱入口及接头处有水滴持续溢出，以保证连接过程中无气泡产生。
5. 连接色谱柱出口端的下游出口，并检查所有接头是否已牢固拧紧。色谱柱连接至系统后，不得超过色谱柱规格中规定的最大压力和流速限制。
6. 用 5 个柱体积（CV）的水清洗色谱柱。如有必要，持续清洗直至 UV280 谱线稳定。
7. 将 A 泵的进样管浸入结合缓冲液中，B 泵的进样管浸入洗脱缓冲液中，样品泵的进样管浸入结合缓冲液中，以使系统在正确的缓冲液中达到平衡。通过手动操作 PumpWash 将缓冲液充满进样管。
8. 在软件的“方法编辑器”模块中，使用方法向导为拟使用的色谱柱设置亲和层析方法。
   注意：自动 FPLC 系统通常预置了推荐设置（即流速和压力限值），并根据所选色谱柱（制造商、基质和尺寸）自动生成运行步骤。
   1. 蛋白 A 亲和层析使用以下运行步骤：
      1. 用 5 CV 的结合缓冲液平衡系统，并将穿流液收集至废液容器中。
      2. 将样品上样至色谱柱（上样体积在方法中手动指定），并将穿流液收集至单独容器中。
      3. 用 5 CV 的结合缓冲液清洗系统，并将穿流液收集至单独容器中。
      4. 使用洗脱缓冲液进行 5 CV 的等度洗脱，通过馏分收集器将纯化的抗体样品以馏分形式收集。
      5. 用 5 CV 的结合缓冲液重新平衡系统，并将穿流液收集至废液容器中。
9. 方法设置完成后，指定需上样至色谱柱的条件培养基体积，并保存该方法。
   注意：方法中指定的体积应比实际体积少 5–10 ml，以避免在样品运行过程中引入空气。本方案中使用的指定体积为 90–120 ml。
10. 将样品泵管路浸入含有条件培养基的容器中。
11. 准备一个单独的容器，通过指定的出口管路收集样品穿流液。
    注意：在运行过程中若发生错误，或色谱柱结合能力超载需重新上样或重复纯化时，收集穿流液至关重要。
12. 在馏分收集器中准备好收集管。每 1 ml 馏分体积加入 100 µl 中和缓冲液。FPLC 系统将自动将各馏分洗脱至收集管中。
13. 在软件的“系统控制”模块中，打开待运行的方法。
    注意：方法运行将通过一系列页面启动，包括检查方法变量、设置馏分收集器以及定义结果文件名和存储位置。
14. 点击“开始”以启动运行。可在“系统控制”模块中监控运行过程。
15. 纯化运行完成后，在系统软件的“评估”模块中查看所得色谱图。
16. 将所有含蛋白的馏分合并至一个单独的离心管中，使用截留分子量为 30 kDa 的离心过滤装置在 PBS 中进行缓冲液置换并浓缩。离心步骤按照制造商说明书操作。
17. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸法（BCA）测定抗体浓度。
18. 若需进行另一次纯化运行，先用结合缓冲液对样品泵管路进行预处理，并重复步骤 1.9–1.14。
19. 完成所有纯化运行后，将 A、B 和样品泵的进样管浸入超纯水中，按照步骤 3 的方法清洗系统和色谱柱。
20. 将 A、B 和样品泵管路浸入 20% 乙醇中，并重复清洗程序，用于系统和色谱柱的储存。
21. 从下游出口断开色谱柱，盖上柱堵头；然后在入口端断开色谱柱并盖上堵头，重新连接管路至系统。将色谱柱于 4 °C 保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，pH 7.4，100 ml	09-2051-100	Astral Scientific
HiTrap Protein A 高性能柱，1 x 5 ml	GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Healthcare	自动化FPLC系统，可包含P-960样品泵和Frac-920组分收集器。
甘氨酸-盐酸（Glycine-HCl）	G2879	Sigma-Aldrich
柠檬酸一水合物	BIOC2123	Astral Scientific
柠檬酸钠，三水合二钠盐	BIOCB0035	Astral Scientific
1 M Tris-HCl 溶液，pH 9.0	BIOSD8146	Astral Scientific
Amicon Ultra 离心滤膜（30 MWCO）	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	用于缓冲液置换和浓缩纯化后的蛋白质。
Pierce 二辛可宁酸（BCA）检测试剂盒	23227	Thermo Fisher Scientific
BLItz 系统	45-5000	fortéBIO	用于生物膜层干涉技术（BLI）测量的仪器。
Protein A 生物传感器	18-5010	fortéBIO