一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术

摘要

来源：Ansorg, A., 等 使用同一宿主物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生。 J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了一种免疫荧光染色方法，用于检测成年海马体中的神经发生。首先，对小鼠脑切片进行处理，使用针对神经前体细胞中与神经发生相关的标志蛋白的一抗孵育。接着，用带有荧光染料标记的二抗进行标记。然后在共聚焦显微镜下观察脑切片，根据不同的标志蛋白组合表达模式，区分各种前体细胞亚型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 组织制备

1. 在灌注前一天配制4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中），4 °C保存。
2. 对深度麻醉的小鼠（3.5%异氟烷）经左心室进行心脏灌注，先灌注10 ml冰冻磷酸盐缓冲液（PBS），再灌注40 ml冰冻多聚甲醛（流速5 ml/min）。取出脑组织，并在相同固定液中后固定24小时，4°C保存。
3. 将脑组织依次转移至10%蔗糖溶液（4°C保存24小时）和30%蔗糖溶液（直至脑组织沉底，约48小时）。冷冻时，将经冷冻保护的脑组织缓慢浸入-25 °C异戊烷中，直至组织不再产生气泡。-80 °C保存。
4. 使用冷冻切片机对脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm（切片机块温度为-25至-16 °C）。将切片按顺序转移至24孔细胞培养板中的抗冻液各孔中（见图1）。-20 °C保存。

2. 免疫染色

注意：切片通常在配备载体板和网状插件的6孔板中进行游离处理。作为例外情况，封闭、抗体孵育以及亲和素-生物素复合物（ABC）反应步骤可在无网状插件的12孔或24孔板中进行（每孔0.5至1 mL即可，具体体积取决于需要染色的切片数量）。在这些步骤中，使用细刷转移切片（每次更换新溶液时需冲洗细刷）。所有孵育步骤均需持续振荡（最高150 rpm）。

1. 免疫组织化学（ABC法）
   1. 将切片从防冻剂转移至三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）中，彻底漂洗（4 °C过夜一次，室温下每次10分钟，重复5次），以完全去除防冻剂。
   2. 为淬灭内源性过氧化物酶活性，用1.5% H₂O₂孵育30分钟₂O₂ 在TBS-Tween 20（TBS-T）中孵育。注意避免气泡产生，必要时重新浸没组织切片。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
   3. 可选： 同时，将加热培养箱和2 N HCl预热至37 °C。为使DNA变性，将切片在37 °C下用2 N HCl孵育30分钟。借助毛笔轻轻分离切片。
   4. 可选： 在室温下，用 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 8.5）中和切片 10 分钟。转移过程中，将含有切片的网插轻轻在纸巾上短暂擦拭，以去除残留的 HCl。随后用 TBS 漂洗 2 次，每次 15 分钟。
   5. 在室温下用 TBSplus 孵育组织 1 小时，以实现组织通透并阻断非特异性抗体结合位点。
   6. 在含TBSplus的稀释液中加入一抗，4 °C孵育过夜。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
   7. 在含TBSplus的生物素化二抗中室温孵育3小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟。同时……
   8. 根据制造商说明书配制ABC复合物（TBS-T中含1% A和1% B），室温静置30分钟后使用。将切片在AB试剂中室温孵育1小时。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
   9. 按每6孔或12孔板准备50 ml浓度为0.5 mg/ml的3,3′-二氨基联苯胺（DAB）TBS-T溶液，均分为两份，分别向每孔加入4 ml或2 ml。将切片转移至DAB溶液中警告！ DAB 具有毒性。请遵循供应商提供的具体化学品安全技术说明书（MSDS）。 即， 穿戴实验服和手套，并在化学通风橱中操作。
   10. 加入0.5 ml 1% H₂O₂ 向剩余的25 ml DAB溶液中加入并混匀，然后同上一步骤，向每孔加入等体积溶液以启动过氧化物酶反应。孵育12分钟。用TBS洗涤3次，每次15分钟。
   11. 将切片用明胶贴附于载玻片上，室温过夜空气干燥。用永久封片剂封片。
   12. 可选： 盖玻片放置前进行复染。
       注意： 如果由于背景过高导致信噪比低，则重复进行H₂O₂ 孵育AB试剂后处理（步骤2.1.8）。
2. 多重免疫荧光
   1. 单重或多重同时免疫荧光
      1. 将切片从防冻液转移至TBS中，彻底漂洗（4 °C过夜一次，室温下每次10分钟，重复5次），以完全去除防冻液。
      2. 可选： 如步骤 2.1.3 - 2.1.4 所述。
      3. 在 TBSplus 中孵育，以通透组织并阻断非特异性抗体结合位点，室温下 1 小时。
      4. 在一抗混合液中孵育（例如， 大鼠抗α-BrdU（溴脱氧尿苷）、豚鼠抗α-DCX（双皮质素）、山羊抗α-GFP（绿色荧光蛋白）），用TBSplus稀释，4°C过夜孵育。用TBS漂洗3次，每次15分钟。
      5. 在荧光染料标记的二抗混合液中孵育（例如， 罗丹明红标记的驴抗大鼠、Alexa-647标记的驴抗豚鼠、Alexa-488标记的驴抗山羊抗体，均用TBSplus缓冲液稀释，室温孵育3小时或4 °C过夜。自此开始，所有步骤均需避光。用TBS缓冲液漂洗3次，每次15分钟。
      6. 将切片用明胶贴附于载玻片上，室温过夜（O/N）晾干。使用水溶性封片剂封片。
   2. 使用同一宿主物种的一抗进行连续多重免疫荧光染色
      1. 同步骤 2.2.1.1 - 2.2.1.3。
      2. 在第一种一抗中孵育（例如， 兔抗α-抗原A），4 °C过夜孵育。在TBS中漂洗3次，每次10分钟，再在TBS-T中漂洗1次，每次10分钟。
      3. 在第一种荧光染料标记的二抗中孵育（例如， 罗丹明红标记的驴抗兔抗体，室温孵育3小时。此后需避光操作。用TBS漂洗3次，每次10分钟，再用TBS-T漂洗1次，10分钟。
      4. 在与一抗相同宿主来源的10%正常血清中孵育（例如， 兔血清）在室温下孵育3小时，以封闭第一种二抗上的游离抗原结合位点。用TBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟，再用TBS-T缓冲液冲洗1次，每次10分钟。
      5. 在含有50 µg/ml针对一抗宿主的未标记单价Fab片段的TBSplus中孵育（例如， 用α-兔IgG（H+L）封闭可能被第二抗体识别的表位，4 °C过夜。
      6. 用 TBS 漂洗至少 3 次，每次 10 分钟，再用 TBS-T 漂洗 1 次，每次 10 分钟。转移过程中，将含有切片的网状插入片在纸巾上短暂轻拭，以去除残留的 Fab 片段。
      7. 孵育第二种一抗（例如， 兔抗α-抗原B），4 °C过夜孵育。在TBS中清洗3次，每次10分钟，再在TBS-T中清洗1次，每次10分钟。
      8. 在第二抗体（与荧光染料偶联）中孵育例如， Alexa-488 标记的驴抗兔抗体），室温孵育 3 小时。用 TBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟，按上述方法封片。
         注意： 若需使用来自不同宿主物种的抗体标记抗原，请将这些抗体添加至步骤 2.2.2.2，相应二抗添加至步骤 2.2.2.3。

结果

图1. 将切片机切片转移至24孔板的示意图。从A1开始，将后续切片依次放入A行；A6之后转至下一行B，依此类推。到达D6后，返回A1并继续。此切片排列方式可实现对整个脑组织每第n^个切片的定量分析。对于新生细胞的定量，取每第6^个脑切片（相当于一列中的所有切片）；对于免疫荧光表型分析，取每第12^个脑切片（相当于某一列中交替两行的切片内容）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织制备
Isoflurane-Actavis	Piramal Healthcare	700211
多聚甲醛粉末 (PFA)	Riedel-De Häen	16005	有毒，易燃
灌注泵 PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon 实验室管路，Ø 0.8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
直型饲喂针，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mm	Agnthos	1036
冷冻切片机 Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24 孔细胞培养板	Greiner Bio-One	662160
免疫组织化学
Tefal vitacuisine 蒸汽锅	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm 聚酯网膜插件	Corning	3479	预装于 6 孔培养板中
Netwell 15 mm 聚酯网膜插件	Corning	3477	预装于 12 孔培养板中
Netwell 塑料 6 孔载体套件	Corning	3521	用于 24 mm 聚酯网膜插件
Netwell 塑料 12 孔载体套件	Corning	3520	用于 15 mm 聚酯网膜插件
Vectastain Elite ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物)	Sigma-Aldrich	D-5637	致癌，避光
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
一抗
兔 IgG1 α-Ki67
兔 α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复
山羊 IgG (H+L) α-GFP	Synaptic Systems	173 002	09:20
小鼠 IgG1 α-nestin	Acris Antibodies	R1091P	06:00
豚鼠 IgG (H+L) α-Doublecortin	Abcam	ab6142	1:200；需抗原修复
大鼠 IgG2a α-BrdU (腹水)	Merck Millipore	AB2253	09:20
大鼠 IgG2a α-BrdU (纯化)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	用于 BrdU 检测；DAB 1:500/IF 1:400
小鼠 IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	用于 CldU 检测；DAB 1:500/IF 1:250-400
小鼠 IgG1 α-NeuN	BD Biosciences	347580	用于 IdU 检测；DAB 1:500/IF 1:350
二抗	Merck Millipore	MAB377	09:20
驴抗豚鼠 IgG (H+L)-生物素
驴抗大鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	711-065-152	09:20
驴抗小鼠 IgG (H+L)-生物素	Dianova	712-065-150	09:20
山羊抗大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	715-065-151	09:20
驴抗山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	05:10
驴抗小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab 片段	Molecular Probes	A11055	05:10
驴抗小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-097-003	02:40
驴抗豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	05:10
驴抗大鼠 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	706-605-148	05:10
驴抗兔 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	712-295-150	05:10
驴抗豚鼠 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	711-295-152	05:10
链霉亲和素-Rhodamine Red-X	Dianova	706-296-148	05:10
山羊抗兔 IgG (H+L)-AMCA	Dianova	016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova	111-155-144	1:250，仅与兔 α-GFAP 配合使用
DAPI	Molecular Probes	H3570	17:40
封闭	Molecular Probes	D1306	17:40
Fab 片段驴抗小鼠 IgG (H+L)
Fab 片段驴抗兔 IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	01:20
正常驴血清	Dianova	711-007-003	01:20
正常兔血清	Merck Millipore	S30
正常山羊血清	Dianova	011-000-010
牛血清白蛋白	Dianova	005-000-001
组织学	Sigma-Aldrich	A7906
焦油紫
Neo-Clear	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Mount	Merck Millipore	109843	无毒二甲苯替代品
显微镜	Merck Millipore	109016	永久封片剂
Axioskop 2
LSM 710	Carl Zeiss Microscopy
	Carl Zeiss Microscopy