来源：Ansorg, A., 等 使用同一宿主物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生。 J. Vis. Exp. (2015)
该视频展示了一种免疫荧光染色方法，用于检测成年海马体中的神经发生。首先，对小鼠脑切片进行处理，使用针对神经前体细胞中与神经发生相关的标志蛋白的一抗孵育。接着，用带有荧光染料标记的二抗进行标记。然后在共聚焦显微镜下观察脑切片，根据不同的标志蛋白组合表达模式，区分各种前体细胞亚型。
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方法文章
一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 组织制备
- 在灌注前一天配制4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中），4 °C保存。
- 对深度麻醉的小鼠（3.5%异氟烷）经左心室进行心脏灌注，先灌注10 ml冰冻磷酸盐缓冲液（PBS），再灌注40 ml冰冻多聚甲醛（流速5 ml/min）。取出脑组织，并在相同固定液中后固定24小时，4°C保存。
- 将脑组织依次转移至10%蔗糖溶液（4°C保存24小时）和30%蔗糖溶液（直至脑组织沉底，约48小时）。冷冻时，将经冷冻保护的脑组织缓慢浸入-25 °C异戊烷中，直至组织不再产生气泡。-80 °C保存。
- 使用冷冻切片机对脑组织进行冠状面切片，厚度为40 µm（切片机块温度为-25至-16 °C）。将切片按顺序转移至24孔细胞培养板中的抗冻液各孔中（见图1）。-20 °C保存。
2. 免疫染色
注意：切片通常在配备载体板和网状插件的6孔板中进行游离处理。作为例外情况，封闭、抗体孵育以及亲和素-生物素复合物（ABC）反应步骤可在无网状插件....
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结果
图1. 将切片机切片转移至24孔板的示意图。从A1开始，将后续切片依次放入A行；A6之后转至下一行B，依此类推。到达D6后，返回A1并继续。此切片排列方式可实现对整个脑组织每第n个切片的定量分析。对于新生细胞的定量，取每第6个脑切片（相当于一列中的所有切片）；对于免疫荧光表型分析，取每第12个脑切片（相当于某一列中交替两行的切片内容）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织制备 | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| 多聚甲醛粉末 (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | 有毒，易燃 |
| 灌注泵 PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon 实验室管路，Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| 直型饲喂针，21 G，1.75 mm 橄榄尖，40 mm | Agnthos | 1036 | |
| 冷冻切片机 Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 孔细胞培养板 | Greiner Bio-One | 662160 | |
| 免疫组织化学 | |||
| Tefal vitacuisine 蒸汽锅 | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm 聚酯网膜插件 | Corning | 3479 | 预装于 6 孔培养板中 |
| Netwell 15 mm 聚酯网膜插件 | Corning | 3477 | 预装于 12 孔培养板中 |
| Netwell 塑料 6 孔载体套件 | Corning | 3521 | 用于 24 mm 聚酯网膜插件 |
| Netwell 塑料 12 孔载体套件 | Corning | 3520 | 用于 15 mm 聚酯网膜插件 |
| Vectastain Elite ABC 试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物) | Sigma-Aldrich | D-5637 | 致癌，避光 |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 一抗 | |||
| 兔 IgG1 α-Ki67 | |||
| 兔 α-GFAP, AS-3-GF | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100；需抗原修复 |
| 山羊 IgG (H+L) α-GFP | Synaptic Systems | 173 002 | 09:20 |
| 小鼠 IgG1 α-nestin | Acris Antibodies | R1091P | 06:00 |
| 豚鼠 IgG (H+L) α-Doublecortin | Abcam | ab6142 | 1:200；需抗原修复 |
| 大鼠 IgG2a α-BrdU (腹水) | Merck Millipore | AB2253 | 09:20 |
| 大鼠 IgG2a α-BrdU (纯化) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | 用于 BrdU 检测；DAB 1:500/IF 1:400 |
| 小鼠 IgG1κ α-BrdU | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | 用于 CldU 检测；DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| 小鼠 IgG1 α-NeuN | BD Biosciences | 347580 | 用于 IdU 检测；DAB 1:500/IF 1:350 |
| 二抗 | Merck Millipore | MAB377 | 09:20 |
| 驴抗豚鼠 IgG (H+L)-生物素 | |||
| 驴抗大鼠 IgG (H+L)-生物素 | Dianova | 711-065-152 | 09:20 |
| 驴抗小鼠 IgG (H+L)-生物素 | Dianova | 712-065-150 | 09:20 |
| 山羊抗大鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Dianova | 715-065-151 | 09:20 |
| 驴抗山羊 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 05:10 |
| 驴抗小鼠 IgG (H+L)-FITC，Fab 片段 | Molecular Probes | A11055 | 05:10 |
| 驴抗小鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-097-003 | 02:40 |
| 驴抗豚鼠 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 05:10 |
| 驴抗大鼠 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-605-148 | 05:10 |
| 驴抗兔 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 05:10 |
| 驴抗豚鼠 IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 05:10 |
| 链霉亲和素-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 05:10 |
| 山羊抗兔 IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 016-290-084 | 09:20 |
| Hoechst 33342 | Dianova | 111-155-144 | 1:250，仅与兔 α-GFAP 配合使用 |
| DAPI | Molecular Probes | H3570 | 17:40 |
| 封闭 | Molecular Probes | D1306 | 17:40 |
| Fab 片段驴抗小鼠 IgG (H+L) | |||
| Fab 片段驴抗兔 IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 01:20 |
| 正常驴血清 | Dianova | 711-007-003 | 01:20 |
| 正常兔血清 | Merck Millipore | S30 | |
| 正常山羊血清 | Dianova | 011-000-010 | |
| 牛血清白蛋白 | Dianova | 005-000-001 | |
| 组织学 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 焦油紫 | |||
| Neo-Clear | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109843 | 无毒二甲苯替代品 |
| 显微镜 | Merck Millipore | 109016 | 永久封片剂 |
| Axioskop 2 | |||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Carl Zeiss Microscopy |
