一种可视化蛋白质亚细胞定位的免疫标记技术

Abstract

来源:Aishwarya， R. 等人 使用量子点介导的免疫标记，然后进行透射电子显微镜检查，可视化蛋白质在心脏中的亚细胞定位。J. Vis. Exp. （2022 年）。

该视频演示了一种使用量子点对小鼠心脏组织切片中的 sigma-1 受体进行免疫标记的技术。心脏组织被固定、渗透、染色、脱水、包埋在树脂中，然后切片。然后用抗体处理切片并用量子点标记，以使用电子显微镜划分 Sigma-1 受体的亚细胞定位。

Protocol

1. 动物准备

1. 使用 3% 异氟醚麻醉小鼠。在中腹部上方的区域做一个水平切口并拉动皮肤，打开胸部。小心地做另一个切口以打开胸腔，不要刺穿任何其他器官。
   1. 先通过心尖灌注心脏，然后使用冷的 3% 戊二醛心脏停搏溶液（50 mM KCl，5% 葡萄糖的 PBS 溶液，见表 1）灌注 2 分钟，以确保心肌完全舒张。
2. 使用冰冷的 3% 戊二醛在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7.4） 中灌注心脏再灌注 2 分钟。利用重力压力，使用 25 G 5/8" 针头将固定剂引入心脏。在心脏开始充满固定剂后，立即抬起心脏的心尖，并在距离心脏 1-2 毫米处切开下面的血管，以减轻压力并让液体排出。
3. 解剖心脏，去除心房，将心室放入培养皿中冰冷的 3% 戊二醛/0.1 M 二甲胂酸钠中。固定 30-60 分钟后做一个蝴蝶形切口，并将其置于含有 3% 戊二醛/二甲胂酸盐的培养皿中（参见材料表）。当心脏在戊二醛/二甲胂酸盐溶液中时，使用手术刀片将心脏切成 1 mm³ 的小方块。
将
4. 解剖的心脏组织在 4 °C 下固定在戊二醛/二甲胂酸盐溶液中 24 小时。

2. 心脏组织处理

1. 固定 24 小时后，在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中洗涤组织 20 分钟。
   1. 按照以下步骤准备 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液。
      1. 要制备 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，通过将二甲胂酸钠 （21.4 g） 和 1% 氯化钙溶液 （3 mL） 溶解在 90 mL 蒸馏水中来制备 1 M 二甲胂酸钠缓冲液。加入蒸馏水，将溶液体积增至 100 mL。充分搅拌溶液并放置过夜以溶解溶质。
      2. 接下来，取 10 mL 1 M 二甲胂酸钠储备液，加入 80 mL 蒸馏水中。使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，并加入蒸馏水将其体积定容至 100 mL。
2. 在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中重复洗涤 20 分钟。从二甲胂酸钠缓冲液中取出组织，并在室温下将它们浸入 2% 四氧化锇溶液中 4 小时。这个过程称为 osmication。
   1. 按照以下步骤制备 2% 四氧化锇溶液。
      1. 要制备 2% 四氧化锇溶液，请取 4% 四氧化锇溶液、4 mL（参见材料表）、1 M 二甲胂酸钠储备液 （0.8 mL） 和蒸馏水 （3.2 mL），制成总共 8 mL 溶液><。 注意:这整个过程和从此开始的步骤必须在通风橱中进行。
3. 渗透后，在室温下将组织浸入 2% 乙酸钠溶液中 10 分钟。
   1. 将 4 g 乙酸钠溶解在 20 mL 蒸馏水中，制备 2% 乙酸钠溶液。
4. 接下来，在室温下将组织浸入 2% 乙酸铀酰溶液中 1 小时。
   1. 通过将 4 g 乙酸铀酰溶解在 20 mL 蒸馏水中来制备 2% 乙酸铀酰溶液。
5. 乙酸铀酰染色后，按照表 2 中提到的顺序，通过分级醇和丙酮依次使组织脱水。

3. 心脏组织包埋

1. 按照以下步骤将脱水的组织包埋在低粘度环氧树脂中。
   1. 要制备低粘度环氧树脂，将 10.24 mL 乙烯基二氧化环己烯环氧树脂单体、6.74 mL 聚氯乙烯二缩水甘油醚 （DER 732） 和 30.05 mL 壬基琥珀酸酐 （NSA）（参见材料表）混合在 50 mL 试管中。用手充分搅拌悬浮液 2 分钟。
   2. 加入 18 滴 2-二甲氨基乙醇（DMAE，参见材料表）环氧树脂促进剂，并搅拌悬浮液以充分混合组分。
   按
   3. 以下混合物顺序将组织浸渍在环氧树脂中。
      1. 用 1:1 树脂:丙酮悬浮液替换 100% 丙酮，并在室温下将组织浸入其中 1 小时。
      2. 用 6:1 树脂:丙酮悬浮液替换 1:1 树脂:丙酮悬浮液，并将组织浸入其中 3 小时。
      3. 最后，用 100% 树脂悬浮液替换 6:1 树脂:丙酮悬浮液，并将组织在室温下浸入其中过夜。
2. 将组织放入 8 mm 微模具中的新鲜树脂中（参见材料表），并在 70 °C 下固化包埋的组织过夜><。 注意:确保树脂固化后坚硬但不脆。

4. 使用超薄切片机进行组织切片

1. 在安装到超薄切片机上之前，用组织将树脂块修剪至不大于 1 mm（参见材料表）。将模具尽可能精确地放置在超薄切片机的分段臂中，然后手动将样品模具推向金刚石刀。
2. 用 Histo 刀（参见材料表）以 500 nm （1/mc） 的厚度切割切片，然后使用 EM 循环工具将它们拾取并放置在载玻片上。
3. 将载玻片放在热板上进行甲苯胺蓝染色，以找到感兴趣的区域。
4. 找到感兴趣的区域后，使用 Ultra 45° 刀（参见材料表）产生淡金色超薄切片 （100 nm）。将这些超薄部分放在 200 目铜网格的暗面。

5. 超薄心脏切片染色

1. 通过使用蚀刻溶液（即 5% 偏高碘酸钠溶液）揭开抗原来开始染色。
   1. 在蒸馏水中制备 500 μL 5% 偏高碘酸钠（参见材料表）溶液。
      注意:使用前准备新鲜溶液。
   2. 将 20 μL 偏高碘酸钠溶液放在干净的石蜡膜上。将带有组织切片的完全干燥的网格放在蚀刻溶液的液滴上。
      注意:带有组织切片的网格的暗面必须面向蚀刻溶液。
   3. 在室温下将切片网格留在溶液上 30 分钟。
2. 将蚀刻的组织切片放在蒸馏水滴上 60 秒，以洗涤蚀刻的组织切片。
3. 在室温下将切片网格放在 0.05 M 甘氨酸溶液的液滴上 10 分钟，以封闭残留的醛。在滤纸上吸干网格的边缘以去除残留的甘氨酸溶液。
   1. 通过将 3.75 mg 甘氨酸溶解在 1 mL 1x PBS （pH 7.4） 中来制备 0.05 M 甘氨酸溶液（参见材料表）。
4. 将切片网格置于 10-20 μL 封闭溶液中，在室温下放置 25 分钟><。 注意:封闭液组成:2 μL 1% 正常山羊血清 （NGS） + 20 μL 1% BSA（终浓度:10%） + 178 μL 1x PBS （pH 7.4），最终体积为 200 μL。
5. 在滤纸上印迹网格边缘，并将网格切片放在抗体稀释剂上，在室温下调节 10 分钟。
6. 将网格切片与一抗（在这种情况下为 Sigmar1，参见材料表;在抗体稀释剂中以 1:10 稀释）在加湿室中孵育 1 小时 30 分钟。
7. 吸干网格，并用抗体稀释剂洗涤网格切片两次，每次 5 分钟。
8. 在加湿室中，将网格切片与生物素化二抗（在这种情况下，生物素化山羊抗兔多克隆二抗，参见材料表;在抗体稀释剂中以 1:10 稀释）孵育 1 小时。
9. 吸干网格，并用抗体稀释剂洗涤网格切片两次，每次 5 分钟。
10. 在室温下的加湿室中，将网格切片在市售链霉亲和素偶联的 QD（QD_655nm，参见材料表;在抗体稀释剂中以 1:10 稀释）孵育 1 小时。用铝箔覆盖腔室，防止暴露在光线下。
11. 用滤纸吸干网格边缘，然后将网格部分放在水滴上 2 分钟以清洗网格部分。
12. 吸干网格的边缘以干燥。

表 1:用于组织脱水的 PBS 和其他溶液的组成。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 缓冲区 组成 数量 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （1x） （1 L） 氯化钠 8 克 氯化钾 0.2 克 磷酸氢二钠 1.44 克 磷酸二氢钾 0.24 克 将 pH 值调节至 7.4

表 2:分级醇和丙酮在组织脱水中的应用（步骤 2.5）

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 元件 时间 50% 乙醇 10 分钟 70% 乙醇 10 分钟 95% 乙醇 10 分钟 100% 乙醇 20 分钟 100% 乙醇 20 分钟 100% 丙酮 30 分钟 100% 丙酮 30 分钟

Materials