一种用于可视化蛋白质亚细胞定位的免疫标记技术

摘要

来源：Aishwarya, R.，等。利用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜观察心脏中蛋白质的亚细胞定位。视觉化实验杂志（2022年）。

本视频演示了一种利用量子点对小鼠心脏组织切片中的σ-1受体进行免疫标记的技术。心脏组织经固定、锇酸处理、染色、脱水后，包埋于树脂中并进行切片。随后，将切片与抗体孵育，并用量子点标记，以通过电子显微镜界定Sigma-1受体的亚细胞定位。

方案

1. 动物准备

1. 使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉。在中腹部上方区域做一水平切口并拉开皮肤以暴露胸腔。小心地再做一切口打开胸腔，注意不要刺破任何其他器官。
   1. 灌注 心尖开始，随后至右心室，使用含50 mM KCl和5%葡萄糖的PBS心肌停搏液配制的4℃ 3%戊二醛进行灌注固定 表12 分钟，以确保心肌完全松弛。
2. 使用冰冻的含3%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）对心脏进行灌注，持续2分钟。利用重力压力，通过25 G 5/8英寸针头将固定液注入心脏。一旦心脏开始充盈固定液，立即抬起心尖，并在距离心脏1–2 mm处剪断其下方的血管以释放压力，使液体得以排出。
3. 解剖心脏，去除心房，将心室放入含冰冻的3%戊二醛/0.1 M二甲胂酸钠的培养皿中。固定30-60分钟后进行蝴蝶形切口，并将其置于含有3%戊二醛/二甲胂酸钠的培养皿中（参见 材料清单）。使用手术刀将心脏切成约1 mm的小块³ 在戊二醛/卡可基酸盐溶液中时。
4. 将解剖后的心脏组织置于戊二醛/卡考基酸盐溶液中，在 4 °C 下固定/浸渍 24 小时。

2. 心脏组织处理

1. 固定24小时后，用0.1 M的卡考基酸钠缓冲液洗涤组织20分钟。
   1. 按照以下步骤配制0.1 M卡考基酸钠缓冲液。
      1. 配制0.1 M卡考基酸钠缓冲液时，先配制1 M卡考基酸钠缓冲液母液：将卡考基酸钠（21.4 g）和1%氯化钙溶液（3 mL）溶于90 mL蒸馏水中，再用蒸馏水定容至100 mL。充分搅拌溶液，并静置过夜以确保溶质完全溶解。
      2. 取10 mL 1 M卡考基酸钠母液加入80 mL蒸馏水中，用HCl调节pH至7.4，再用蒸馏水定容至100 mL。
2. 再次用0.1 M卡考基酸钠缓冲液洗涤组织20分钟。将组织从卡考基酸钠缓冲液中取出，浸入2%四氧化锇溶液中，在室温下处理4小时。此过程称为锇酸化处理。
   1. 按照以下步骤配制2%四氧化锇溶液。
      1. 配制2%四氧化锇溶液时，取4%四氧化锇溶液4 mL（见材料表）、1 M卡考基酸钠母液0.8 mL以及蒸馏水3.2 mL，混合成总体积为8 mL的溶液。
         注意：此整个过程及后续所有步骤均须在通风橱中进行。
3. 锇酸化处理后，将组织在2%乙酸钠溶液中室温下浸渍10分钟。
   1. 通过将4 g乙酸钠溶解于20 mL蒸馏水中，配制2%乙酸钠溶液。
4. 接着，将组织在2%醋酸铀溶液中室温下浸渍1小时。
   1. 通过将4 g醋酸铀溶解于20 mL蒸馏水中，配制2%醋酸铀溶液。
5. 醋酸铀染色后，按照表2中列出的顺序，使用梯度酒精和丙酮对组织进行逐级脱水。

3. 心脏组织包埋

1. 按照以下步骤将脱水后的组织包埋于低黏度环氧树脂中。
   1. 配制低黏度环氧树脂：取10.24 mL乙烯基环己烯二氧化物环氧单体、6.74 mL聚丙二醇二缩水甘油醚（DER 732）和30.05 mL壬烯基琥珀酸酐（NSA）（见材料表），加入50 mL离心管中，手动充分搅拌2分钟。
   2. 加入18滴2-二甲氨基乙醇（DMAE，见材料表）环氧促进剂，搅拌使各组分充分混合。
   3. 按以下混合顺序用环氧树脂对组织进行浸渍。
      1. 用1:1树脂:丙酮混合液替换100%丙酮，将组织浸入其中，室温下放置1小时。
      2. 用6:1树脂:丙酮混合液替换1:1树脂:丙酮混合液，将组织浸入其中，室温下放置3小时。
      3. 最后，用100%树脂替换6:1树脂:丙酮混合液，将组织在其中浸渍过夜，室温保存。
2. 将组织放入盛有新鲜树脂的8 mm微型模具中（见材料表），于70 °C下过夜固化。
   注意：确保树脂固化后坚硬但不脆。

4. 使用超薄切片机进行组织切片

1. 将包埋有组织的树脂块修整至不超过 1 mm，然后安装到超薄切片机上（参见材料表）。将模具尽可能精确地放置在超薄切片机的分段臂中，并手动推进样品模具靠近金刚石刀。
2. 使用组织切片刀（Histo knife）（参见材料表）以 500 nm（半微米）的厚度进行切片，用电子显微镜载网环（EM loop tool）捞取切片，并将其置于载玻片上。
3. 将载玻片放置在加热板上，进行甲苯胺蓝染色以定位目标区域。
4. 找到目标区域后，使用 45° 超薄切片刀（Ultra 45° knife）（参见材料表）切出呈淡金黄色的超薄切片（100 nm），并将这些超薄切片置于 200 目铜网的哑面一侧。

5. 心脏超薄切片染色

1. 使用蚀刻液（即 5% 高碘酸钠溶液）进行抗原去遮蔽，开始染色步骤。
   1. 在蒸馏水中配制 500 µL 的 5% 高碘酸钠（见材料表）溶液。
      注意：使用前新鲜配制。
   2. 取 20 µL 高碘酸钠溶液滴加于洁净的石蜡膜上，将完全干燥并带有组织切片的载网置于该蚀刻液滴中。
      注意：载网带有组织切片的一侧（无光泽面）必须朝向蚀刻液。
   3. 室温下孵育 30 分钟。
2. 将经蚀刻处理的组织切片置于一滴蒸馏水中，清洗 60 秒。
3. 将载网切片置于 0.05 M 甘氨酸溶液中孵育 10 分钟（室温），以封闭残余醛基；用滤纸轻吸载网边缘，去除残留的甘氨酸溶液。
   1. 通过将 3.75 mg 甘氨酸溶解于 1 mL 的 1× PBS（pH 7.4）中，配制 0.05 M 甘氨酸溶液（见材料表）。
4. 将载网切片置于 10–20 µL 封闭液中，室温孵育 25 分钟。
   注意：封闭液组成：1% 正常山羊血清（NGS）2 µL + 1% BSA（终浓度 10%）20 µL + 1× PBS（pH 7.4）178 µL，总体积为 200 µL。
5. 用滤纸吸干载网边缘，将载网切片转移至抗体稀释液中，室温下预处理 10 分钟。
6. 将载网切片与一抗（本实验中为 Sigmar1，见材料表；以抗体稀释液按 1:10 稀释）在湿化 chamber 中孵育 1 小时 30 分钟。
7. 吸干载网，用抗体稀释液清洗载网切片两次，每次 5 分钟。
8. 将载网切片与生物素标记的二抗（本实验中为生物素化山羊抗兔多克隆二抗，见材料表；以抗体稀释液按 1:10 稀释）在湿化 chamber 中孵育 1 小时。
9. 吸干载网，用抗体稀释液清洗载网切片两次，每次 5 分钟。
10. 将载网切片在商品化的链霉亲和素偶联量子点（QD_655nm，见材料表；以抗体稀释液按 1:10 稀释）中室温孵育 1 小时，置于湿化 chamber 内，并用铝箔包裹避光。
11. 用滤纸吸干载网边缘，将载网切片置于水滴中清洗 2 分钟。
12. 用滤纸吸干载网边缘，使其干燥。

表1：PBS及其他用于组织脱水的溶液的组成。

缓冲液	成分	用量
磷酸盐缓冲液 (PBS) (1x) (1 L)	氯化钠	8 g
	氯化钾	0.2 g
	磷酸氢二钠	1.44 g
	磷酸二氢钾	0.24 g
	调节 pH 至 7.4

表2：梯度酒精和丙酮用于组织脱水的应用（步骤2.5）

组分	时间
50% 乙醇	10 分钟
70% 乙醇	10 分钟
95% 乙醇	10 分钟
100% 乙醇	20 分钟
100% 乙醇	20 分钟
100% 丙酮	30 分钟
100% 丙酮	30 分钟

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200目铜网	Ted Pella	G200HH
FVB/N背景的6月龄雄性小鼠	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
丙酮 100%	Fisher Chemicals	A949
抗体稀释液	Dako	S3022
抗Sigmar1抗体	Cell Signaling	61994S
生物素标记的山羊抗兔IgG抗体	Sigma Aldrich	B7389
牛血清白蛋白（10%）	Electron Microscopy Sciences	25557
氯化钙	Sigma Aldrich	C7902
Cytoseal Xyl	Thermo fisher	8312-4
DER 732C36AA10:C33	Electron Microscopy Sciences	13010
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528
金刚石刀	Diatome	Histo; Ultra 450
DMAE	Electron Microscopy Sciences	13300
电子显微镜	JEOL	JEOL-1400 Flash
ERL 4221	Electron Microscopy Sciences	15004
乙醇 100%	Fisher Chemicals	A405P
3% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16538-15
甘氨酸	Alfa Aesar	A13816
盐酸	Fisher Scientific	SA56
微模具	Ted Pella	10505
超薄切片机	Leica Microsystem	EM UC7
正常山羊血清	Invitrogen	PCN5000
NSA	Electron Microscopy Sciences	19050
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19150
Parafilm封口膜	Genesse Scientific	16-101
氯化钾	Sigma Aldrich	P5655
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	71640
Qdot 655链霉亲和素偶联物	Invitrogen	Q10121MP
乙酸钠	Fisher Scientific	BP334
二甲胂酸钠	Electron Microscopy Sciences	12300
氯化钠	Fisher Scientific	BP358
偏高碘酸钠	Sigma Aldrich	71859
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	P9541
手术刀片（10号）	Aspen surgical	371110
透射电镜图像软件	AMT-V700	AMT TEM imaging systems
透射电镜成像相机	XR80 TEM系列	AMT TEM imaging systems
甲苯胺蓝O溶液（0.5%）	Fisher Scientic	S25612
醋酸铀酰	Polysciences	21447