一种用于肾脏三维成像的全器官整体染色技术

摘要

来源：Hasegawa, S.，等。利用CUBIC进行全肾脏三维染色。J. Vis. Exp. （2022）。

本视频演示了一种利用CUBIC（透明、无阻碍的脑/体成像鸡尾酒溶液及计算分析）组织透明化方法结合免疫荧光染色技术，对小鼠肾脏进行整体染色的实验方法。肾脏经过组织透明化处理，包括去脂、脱色以及折射率匹配溶液处理，从而使组织变得透明，以实现最佳的三维成像效果。随后使用荧光标记的抗体对组织进行染色，并在光片显微镜下观察肾脏中的交感神经和动脉结构。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物准备与肾脏固定

1. 按照以下步骤进行灌注固定。
   1. 通过吸入异氟烷（3%，2.0 L/min）以及腹腔注射盐酸美托咪定（0.3 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）和咪达唑仑（4 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见 材料表).
   2. 通过左心室灌注 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 30 mL 4% 多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液。
2. 灌注固定并取肾组织后，立即进行浸入式固定。
   1. 将肾脏置于4% PFA中，4 °C条件下继续固定16小时，然后用PBS洗涤2小时（共三次）9图1).
      ​警告： 甲醛和多聚甲醛是有毒刺激物。操作这些试剂时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

2. 脱色与脱脂

1. 配制用于脱色和脱脂的CUBIC-L（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis）溶液，包含10 wt% Triton X-100和10 wt% N-丁基二乙醇胺（见 材料表），参照已发表的文献报道。
2. 按照以下步骤使用CUBIC-L进行脱色和脱脂。
   1. 将固定好的肾脏浸入含有 7 mL 50% (v/v) CUBIC-L（水与 CUBIC-L 按 1:1 体积比混合）的 14 mL 圆底试管中（参见 材料表）在室温下轻柔振荡孵育6小时（图2A然后，将其置于14 mL圆底管中，加入7 mL CUBIC-L溶液，在37 °C下轻轻振荡孵育5天。
   2. 在此过程中每天更换CUBIC-L。脱色和脱脂过程完成后，用PBS在室温下洗涤肾脏2小时（共三次）图1）。使用分液勺进行样品处理（图2B).

3. 整体免疫荧光染色

1. 准备染色缓冲液。
   1. 通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.5% 酪蛋白溶于PBS中，并加入0.05% 叠氮化钠，配制一抗染色缓冲液。
   2. 通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.1% 酪蛋白溶于PBS中，并加入0.05% 叠氮化钠，配制二抗染色缓冲液。
2. 进行一抗染色。
   1. 在染色缓冲液中，以一抗（1:100 或 1:200，参见材料表）对脱脂肾脏进行免疫染色，37 °C条件下轻柔振荡孵育7天。
      注意：一个肾脏所需的染色缓冲液体积为500–600 µL（图2C）。
   2. 在室温下用含0.5% (v/v) Triton X-100的PBS（PBST）洗涤肾脏1天（图1）。
3. 进行二抗染色。
   1. 在染色缓冲液中，以二抗（1:100 或 1:200，参见材料表）对肾脏进行免疫染色，37 °C条件下轻柔振荡孵育7天。随后在室温下用PBST洗涤肾脏1天（图1）。
   2. 染色后固定：将肾脏浸入含1% 甲醛的PB溶液（37% 甲醛与PB按1:36比例混合）中固定3小时，然后在室温下用PBS洗涤6小时（图1）。

4. 折射率（RI）匹配

1. 配制 CUBIC-R+。
   1. 通过混合45 wt%的2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林和30 wt%的烟酰胺来配制CUBIC-R（见材料表）。
   2. 根据先前发表的研究，在CUBIC-R中加入0.5 v%的N-丁基二乙醇胺，以制备用于折射率（RI）匹配的CUBIC-R+。
2. 进行折射率匹配。
   1. 将肾脏置于14 mL圆底管中，加入7 mL 50%（v/v）CUBIC-R+（水与CUBIC-R+按1:1体积比混合），在室温下轻轻振荡孵育1天。随后，更换为7 mL纯CUBIC-R+，在相同容器中继续于室温下轻轻振荡孵育2天（图1）。
      注意：尽管在折射率匹配初期肾脏会漂浮于50% CUBIC-R+溶液中，但在CUBIC-R+处理结束时，肾脏会下沉并变得透明（图2D）。

5. 图像采集与重建

1. 在图像采集过程中，将折射率匹配的肾脏浸入硅油（折射率 = 1.555）与矿物油（折射率 = 1.467）按55:45比例混合的溶液中（总体折射率 = 1.51）（图3）。
2. 使用自行搭建的光片荧光显微镜对整个肾脏进行三维成像（参见材料表）。所有原始图像数据以16位TIFF格式保存。利用图像分析软件（Imaris，参见材料表）对三维重建图像进行可视化与采集。

结果

图1：组织透明化与整体免疫荧光染色。 采用CUBIC法进行组织透明化是一个两步过程：脱脂（CUBIC-L）和折射率（RI）匹配（CUBIC-R+）。整体染色在脱脂步骤完成后进行。比例尺 = 10 mm。该图像引自Hasegawa等人的研究。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 圆底高透明度聚丙烯测试管	Falcon	352059	组织透明化、染色、洗涤
2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37% 甲醛溶液	Nacalai Tesque	16223-55	后固定
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液	Nacalai Tesque	09154-85	肾脏固定
Alexa Fluor 555 标记的驴抗羊 IgG 抗体	Invitrogen	A-21436	二抗 (1:100)
Alexa Fluor 647 标记的驴抗兔 IgG 抗体	Invitrogen	A-31573	二抗 (1:200)
抗水通道蛋白 2 (AQP2) 抗体	Abcam	ab199975	一抗 (1:100)
抗足细胞裂隙蛋白 (podocin) 抗体	Sigma-Aldrich	P0372	一抗 (1:100)
抗钠-葡萄糖协同转运蛋白 2 (SGLT2) 抗体	Abcam	ab85626	一抗 (1:100)
抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体	Abcam	ab113	一抗 (1:100)
抗α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 抗体	Abcam	ab5694	一抗 (1:200)
PBS 中的酪蛋白封闭剂	Thermo Fisher Scientific	37528	染色缓冲液
酒石酸布托啡诺	Meiji	5526	麻醉剂
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	小鼠品系
Imaris	Bitplane	N/A	成像分析软件
宏变焦显微镜	OLYMPUS	MVX10	定制显微镜的观察单元
盐酸美托咪啶	Kyoritsu-Seiyaku	8656	麻醉剂
咪达唑仑	SANDOZ	27803229	麻醉剂
矿物油	Sigma-Aldrich	M8410	浸没油
N-丁基二乙醇胺	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
烟酰胺	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
硅油 HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	浸没油
叠氮化钠	Wako	195-11092	染色缓冲液