一种用于检测皮肤活检切片中α-突触核蛋白聚集物的免疫荧光检测法

摘要

来源：Vacchi, E., 等. 通过游离免疫荧光检测法靶向皮肤周围神经纤维中的α-突触核蛋白聚集物. J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了一种免疫荧光检测方法，用于检测皮肤活检切片中与神经退行性疾病特异性的α-突触核蛋白聚集体。采用游离漂浮免疫染色法，对真皮神经元中的羧基末端水解酶和α-突触核蛋白聚集体进行荧光标记。在共聚焦显微镜下，同时显示两种抗体荧光信号的细胞表明真皮神经元中存在α-突触核蛋白聚集体。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 皮肤活检样本采集

1. 由具备资质的医师在适当的临床环境中进行皮肤活检。
2. 选择皮肤活检部位，并用酒精棉片清洁该区域。
3. 使用1 cc的2%利多卡因制备麻醉液。
4. 将针头与皮肤表面平行，皮下注射局部麻醉剂。
5. 确认麻醉效果后，取3 mm一次性活检钻头，施加旋转并轻柔向下的压力，旋转穿透表皮和真皮，直至达到皮下脂肪层。
6. 退出钻头。
7. 使用一次性镊子轻轻提起皮肤组织柱。
8. 用剪刀在脂肪组织水平处剪断标本基部。
9. 将标本放入含有10 mL高碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液的试管中。
10. 对操作区域进行消毒，并贴上粘性创可贴覆盖。

2. 组织固定与保存

1. 配制新鲜的PLP固定液（见 表1）。
2. 皮肤活检样本采集后，立即将其浸入含有10 mL PLP固定液的离心管中，于4 °C条件下过夜（O/N）孵育。
3. 次日，在通风橱内小心移除PLP固定液，随后在同一离心管中用5 mL 0.1 M Sorensen's缓冲液洗涤活检组织3次，每次5分钟（表1）。
4. 弃去Sorensen's缓冲液，加入5 mL冷冻保护液，于4 °C条件下过夜（O/N）孵育。
5. 若在一星期内使用冷冻切片机进行切片，可将组织保存于4 °C；若在三个月内切片，应保存于-20 °C；如需长期保存，应将组织包埋于冷冻模具中（步骤3.2–3.4），并置于-80 °C保存。

3. 使用冷冻切片机切割组织

1. 将冷冻切片机设定在 -20 °C。
2. 取一个冷冻模具，加入冷冻包埋介质，避免产生气泡。
3. 使用镊子将活检组织浸入冷冻包埋介质中，使组织的长轴（表皮-真皮方向）与冷冻模具底部平行。
4. 用液氮快速冷冻样品，形成含有活检组织且方向正确的冷冻包埋介质固体块。
5. 将样品放入冷冻切片机中，静置 30 分钟，使活检组织适应温度环境。
6. 固定样品于冷冻切片机上，切取 50 µm 厚的切片。
7. 借助小刷子，将冷冻切片转移至 96 孔板中，每孔预先加入 200 µL 防冻液，每孔放置一片切片。
8. 在 -20 °C 下保存。
   注意： 若无需分析整个活检组织，可仅部分切取。此时，切下的切片应保存于 -20 °C，剩余的活检组织则应保存于 -80 °C，以延长保存时间。

4. 免疫荧光染色

1. 用 100 µL 洗涤液填充 96 孔板。
2. 将待分析的组织切片从储存板转移至含有洗涤液的新板中，每孔放置 1 片（每位患者每个解剖部位 4 片：通常每位患者共 12 片）。
3. 在室温（RT）下将切片置于洗涤液中孵育 10 分钟。将切片转移至另一含有相同溶液的孔中，重复洗涤一次。
4. 将切片转移至含有 100 µL 封闭液的新孔中，在室温下孵育至少 90 分钟，最长不超过 4 小时。
5. 用工作液稀释一抗：抗 PGP9.5 抗体（兔多克隆抗体，1:1000）和抗 5G4 抗体（鼠单克隆抗体，1:400）。
6. 将切片转移至含有 100 µL 一抗工作液的新孔中，在室温下过夜孵育（O/N）。
7. 参照步骤 4.3，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片至少 2 次，每次不少于 10 分钟。
8. 用工作液稀释二抗（与不同荧光染料偶联）：用于检测 PGP9.5 的 Goat anti-Rabbit 抗体（1:700）和用于检测 5G4 的 Goat anti-Mouse 抗体（1:700）。
9. 将切片转移至含有 100 µL 二抗工作液的新孔中，在室温下孵育 90 分钟。自此步骤起，用铝箔包裹 96 孔板以避免荧光染料偶联的二抗发生荧光淬灭。
10. 参照步骤 4.3，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片至少 2 次，每次不少于 10 分钟。
11. 将切片转移至含有 100 µL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，用 1× 磷酸盐缓冲液 [PBS] 稀释 1:5,000）的新孔中，在室温下孵育 5 分钟。
12. 参照步骤 4.3，用 100 µL 洗涤液在室温下洗涤切片至少 2 次，每次不少于 10 分钟。
13. 将切片正确地置于载玻片上，避免折叠错位。
14. 在载玻片上滴加数滴封片剂，并加盖盖玻片。
15. 在使用共聚焦/荧光显微镜前，将载玻片过夜干燥（O/N）。
16. 将载玻片置于适当的盒子中，在 4 °C 避光保存。若妥善保存，信号可维持约 6 个月。
    注意： 将切片从含有新切组织片的 96 孔板转移至含有洗涤液的 96 孔板（步骤 4.1）时，使用小刷子辅助拾取活检组织。在将切片转移至第一孔后，每次需更换孵育溶液时，均使用该刷子协助在孔间转移切片。

5. 免疫荧光成像

1. 在倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察切片（使用20X、40X或更高倍数的物镜，为获得最佳结果，建议在Z轴堆栈平面上以2 µm的步长连续成像）。
2. 通过显微镜连接的相机获取图像。
3. 使用合适的成像软件（例如ImageJ），对切片中阳性信号的空间分布和信号强度进行分析。请按照以下步骤操作：
   1. 使用ImageJ软件打开文件。
   2. 点击 Image > color > split channels ，以分别分析各个颜色通道。
   3. 点击 Image > stack > Z project ，以合并多个切片图像的采集结果。
   4. 点击 Image > color > merge channels，以合并同一图像采集中的不同颜色通道。

表1： 所需溶液。 本实验方案所需溶液列表及配制方法的简要说明。

抗冻液 （4 °C 保存，可存放长达 6 个月）	30% 甘油 30% 乙二醇 30% dH2O 10% 2x 磷酸盐缓冲液
封闭液 （现配）	4% 正常山羊血清 1% Triton X-100 在洗涤液中
冷冻保护剂 （4 °C 保存，可保存长达 6 个月）	20% 甘油 80% 索伦森溶液
磷酸氢二钠溶液 （室温保存，最长6个月）	0.45 M 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)2HPO₄) 在 dH₂O 中2O 在无菌瓶中过滤
赖氨酸溶液 （4 °C 保存，最长可保存 3 周）	0.3 M L-赖氨酸单盐酸盐溶液的50% 0.1 M Sorensen 缓冲液，pH 7.6，50% pH 7.4，于无菌瓶中过滤
8% 多聚甲醛（PFA） （在通风橱中配制，4 °C 保存，可存放长达1个月）	2.6 M PFA in dH₂O2O（升温至 55°C，不得超过 60°C） 以避免甲酸的形成） 在无菌瓶中过滤
2倍磷酸盐缓冲液 （4 °C 保存，可存放长达 6 个月）	6% 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）2PO4）溶液 45% 磷酸二钠（Na2HPO4) 溶液于 dH₂O 中2O
PLP固定剂溶液 （在通风橱中即时配制）	25% 多聚甲醛 8% 0.01 M 高碘酸钠 75% 赖氨酸溶液
一水合二氢磷酸钠 （室温保存，最长6个月）	0.52 M 磷酸二氢钠一水合物（NaH₂PO₄·H₂O）2PO4H*2O) 在 dH₂O 中2O 在无菌瓶中过滤。
索伦森溶液 （4 °C 保存，最长可保存 1 个月）	2.5% 磷酸二氢钠溶液 18.7% 磷酸氢二钠溶液 pH 7.6，于 dH₂O 中2O
洗涤液 （现配现用）	0.25 M Trizma 碱 0.26 M NaCl pH 7.6，于 dH 水中2O
工作溶液 （现配）	50% 封闭液 50% 洗涤液

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5G4（抗人α-突触核蛋白5G4）	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	小鼠单克隆
AlexaFluor 488 山羊抗兔 IgG	Invitrogen	1971418	2mg/ml
AlexaFluor 594 山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	1922849	2mg/ml
磷酸氢二钠溶液	Merk Millipore	106586
乙二醇	Sigma-Aldrich	324558
甘油	Sigma-Aldrich	G7757
L-赖氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	L5626
多聚甲醛	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	兔多克隆
氯化钠	Sigma	S3014
一水合磷酸二氢钠	Merck Millipore	106346
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
吐温X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	封片剂