一种用于检测皮肤活检切片中α-突触核蛋白聚集物的免疫荧光检测法

摘要

来源：Vacchi, E., 等. 通过游离免疫荧光检测法靶向皮肤周围神经纤维中的α-突触核蛋白聚集物. J. Vis. Exp. (2019).

本视频演示了一种免疫荧光检测方法，用于检测皮肤活检切片中与神经退行性疾病特异性的α-突触核蛋白聚集体。采用游离漂浮免疫染色法，对真皮神经元中的羧基末端水解酶和α-突触核蛋白聚集体进行荧光标记。在共聚焦显微镜下，同时显示两种抗体荧光信号的细胞表明真皮神经元中存在α-突触核蛋白聚集体。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 皮肤活检样本采集

1. 由具备资质的医师在适当的临床环境中进行皮肤活检。
2. 选择皮肤活检部位，并用酒精棉片清洁该区域。
3. 使用1 cc的2%利多卡因制备麻醉液。
4. 将针头与皮肤表面平行，皮下注射局部麻醉剂。
5. 确认麻醉效果后，取3 mm一次性活检钻头，施加旋转并轻柔向下的压力，旋转穿透表皮和真皮，直至达到皮下脂肪层。
6. 退出钻头。
7. 使用一次性镊子轻轻提起皮肤组织柱。
8. 用剪刀在脂肪组织水平处剪断标本基部。
9. 将标本放入含有10 mL高碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液的试管中。
10. 对操作区域进行消毒，并贴上粘性创可贴覆盖。

2. 组织固定与保存

1. 配制新鲜的PLP固定液（见 表1）。
2. 皮肤活检样本采集后，立即将其浸入含有10 mL PLP固定液的离心管中，于4 °C条件下过夜（O/N）孵育。
3. 次日，在通风橱内小心移除PLP固定液，随后在同一离心管中用5 mL 0.1 M Sorensen's缓冲....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5G4（抗人α-突触核蛋白5G4）	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	小鼠单克隆
AlexaFluor 488 山羊抗兔 IgG	Invitrogen	1971418	2mg/ml
AlexaFluor 594 山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	1922849	2mg/ml
磷酸氢二钠溶液	Merk Millipore	106586
乙二醇	Sigma-Aldrich	324558
甘油	Sigma-Aldrich	G7757
L-赖氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	L5626
多聚甲醛	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	兔多克隆
氯化钠	Sigma	S3014
一水合磷酸二氢钠	Merck Millipore	106346
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
吐温X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	封片剂