利用荧光介导断层成像评估小鼠肠道炎症

摘要

来源：Nowacki, T. M.，等。荧光介导断层成像技术用于检测和定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用荧光介导断层扫描（FMT）在结肠炎小鼠模型中评估肠道巨噬细胞浸润的技术。通过葡聚糖硫酸钠（DSS）在小鼠体内诱导结肠炎后，向动物注射可识别结肠内浸润巨噬细胞表面F4/80糖蛋白标志物的抗体。随后将小鼠置于FMT设备中成像，荧光信号与反射信号被重建为三维图像，以确定荧光的空间分布及强度。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料与实验设置

1. 动物护理。
   1. 使用体重为20-25 g、性别和年龄相匹配的任何对DSS敏感品系的小鼠（例如，C57BL/6）。
   2. 每个实验组至少准备五只或更多小鼠，并根据当地动物护理指南进行饲养。
   3. 自由提供标准啮齿类动物饲料和高压灭菌饮用水 ad libitum。
   4. 在扫描前至少三天，移除标准饲料并替换为无苜蓿饲料，以减少管腔内自发荧光。
2. 急性DSS诱导性结肠炎的建立。
   1. 将2 g DSS（分子量约40,000 Da）溶解于100 mL高压灭菌饮水中，配制成2%（w/v）溶液。
   2. 仅向小鼠提供该DSS溶液作为饮用水，每只小鼠每日预计消耗5 mL。对照组小鼠则给予不含DSS的相同饮用水。
      注意：实验期间每日监测小鼠状态直至实验结束。根据当地适用的动物福利指南，对体重减轻超过初始体重20%或出现濒死状态（即持续弓背姿势、活动减少、呼吸困难、毛发明显竖立）的小鼠实施安乐死。

结果

图 1. 小鼠结肠炎中巨噬细胞浸润的断层成像可视化。

对结肠炎小鼠和非结肠炎对照小鼠（每组 n = 5）注射与 Cyanine7 偶联的抗小鼠 F4/80 抗体后进行 FMT 扫描。（A） 柱状图：在 ROI 中测定的染料总荧光强度（以 pmol 计），以均值 ± 标准误（SEM）表示。代表性图像显示了颜色编码的荧光强度，对应于注射特异性探针（抗小鼠 F4/80）（B） 和非特异性对照（大鼠 IgG）（C） 小鼠中炎性浸润的程度。在这两种情况下，均在上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
苜蓿-free饲料	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen眼膏	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
葡聚糖硫酸钠（DSS）	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
伊红	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
苏木精	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek包埋剂	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583	组织学分析用固定剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza, Verviers, Belgium	4629
氯化钠 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
碳酸氢钠粉末	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany	S5761
标准饲料	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek冷冻模具	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Hemoccult（愈创木脂试纸检测）	Beckmann Coulter, Germany	3060
生物素标记大鼠抗小鼠F4/80抗体	Serotec, Oxford, UK	MCA497B
生物素标记大鼠抗小鼠GR-1抗体	BD Pharmingen, Heidelberg Germany	553125
链霉亲和素-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Germany	S-11225	激发/发射最大值：556/573 nm
抗CD11b大鼠抗小鼠抗体TC	Calteg, Burlingame, USA	R2b06
纯化抗小鼠F4/80抗体	BioLegend, London, UK	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	D9542
FITC标记抗Ly6C大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	553104
FACS缓冲液	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	342003
Cy7 NHS酯	GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany	K 6631B
Cy5.5标记抗小鼠F4/80抗体	BioLegend, London, UK	123127	即用型标记抗体（替代品）
抗小鼠F4/80抗原PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, USA	45-4801-80	即用型标记抗体（替代品）
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	67-68-5
异氟烷	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	792632
乙醇	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	64-17-5
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	A4612
Tris缓冲盐溶液（TBS）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	SRE0032
设备
FACS Calibur流式细胞仪系统	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
FMT 2000活体成像系统	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1成像分析软件	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	包含于FMT2000中
Leica DMLB荧光显微镜	Leica, 35578 Wetzlar, Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Germany	HD 2070	超声波匀浆器
一次性手术刀片 No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum剪刀 14 cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany	22398330
鲁尔锁扣注射器 5 ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z248010
注射器针头	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z192368
Falcon管 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070