利用荧光介导断层成像评估小鼠肠道炎症

摘要

来源：Nowacki, T. M.，等。荧光介导断层成像技术用于检测和定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用荧光介导断层扫描（FMT）在结肠炎小鼠模型中评估肠道巨噬细胞浸润的技术。通过葡聚糖硫酸钠（DSS）在小鼠体内诱导结肠炎后，向动物注射可识别结肠内浸润巨噬细胞表面F4/80糖蛋白标志物的抗体。随后将小鼠置于FMT设备中成像，荧光信号与反射信号被重建为三维图像，以确定荧光的空间分布及强度。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料与实验设置

1. 动物护理。
   1. 使用体重为20-25 g、性别和年龄相匹配的任何对DSS敏感品系的小鼠（例如，C57BL/6）。
   2. 每个实验组至少准备五只或更多小鼠，并根据当地动物护理指南进行饲养。
   3. 自由提供标准啮齿类动物饲料和高压灭菌饮用水 ad libitum。
   4. 在扫描前至少三天，移除标准饲料并替换为无苜蓿饲料，以减少管腔内自发荧光。
2. 急性DSS诱导性结肠炎的建立。
   1. 将2 g DSS（分子量约40,000 Da）溶解于100 mL高压灭菌饮水中，配制成2%（w/v）溶液。
   2. 仅向小鼠提供该DSS溶液作为饮用水，每只小鼠每日预计消耗5 mL。对照组小鼠则给予不含DSS的相同饮用水。
      注意：实验期间每日监测小鼠状态直至实验结束。根据当地适用的动物福利指南，对体重减轻超过初始体重20%或出现濒死状态（即持续弓背姿势、活动减少、呼吸困难、毛发明显竖立）的小鼠实施安乐死。
3. 荧光介导断层成像的准备。
   1. 按照制造商说明书，用荧光染料（例如，Cyanine7，λ_excitation：750 nm，λ_emission：776 nm）标记目标抗体（例如，大鼠抗小鼠F4/80抗体）。将纯化的抗体置于适当的透析膜（截留分子量 < 50-100 kDa）中，对1 L 0.15 M氯化钠溶液透析至少2小时或过夜。
      1. 将抗体转移至1 L 0.1 M NaHCO₃ 溶液中，再透析至少2小时。
      2. 将所需量的荧光染料溶于二甲基亚砜（DMSO）（每毫克抗体使用10.8 µL）中，然后加入抗体溶液。使用摩尔过量20倍的荧光染料，以获得染料与蛋白质比例为1:3的标记产物。
      3. 在4 °C避光孵育1小时。通过透析（使用1 L 0.15 M氯化钠溶液）或PD-10脱盐柱去除未结合的染料，并将标记后的抗体溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中用于体内应用。
      4. 通过分光光度法测定最终抗体浓度和标记比率。
      5. 在250-330 nm波长下测定蛋白浓度时，需考虑染料的额外吸收。对于Cyanine标记，应从280 nm处的最大吸光度（蛋白）中减去750 nm处最大吸光度的11%进行校正（见下一步）。
      6. 测定化合物稀释液（通常为1:10）在250-800 nm范围内的吸光度，并提取750 nm处Cyanine7的浓度。
      7. 计算染料与蛋白的比例：染料/抗体 = 750 nm处最大吸光度 / 200,000 / （280 nm处最大吸光度 - 0.11 × 750 nm处最大吸光度）/ 170,000。
      8. 将抗体溶液保存在4 °C环境中，并避光以防在注射前发生荧光淬灭。
   2. 在注射前立即用无菌注射器吸取所需量的抗体溶液，并在使用前保持避光。
   3. 根据示踪剂的药代动力学确定探针注射与扫描程序的最佳时间点。
   4. 通过吸入1.5–2.5%异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉，或将其稳妥固定于专用束缚装置中，以便经尾静脉注射标记抗体。
   5. 对于全长抗体，应在扫描前至少24小时注射标记抗体，例如用于小鼠结肠炎模型中抗小鼠F4/80巨噬细胞的可视化。通过尾静脉以静脉注射（i.v.）方式给予每只小鼠相当于2.0 nmol染料剂量的标记抗体。
   6. 使用相同标记的非特异性抗体（例如，大鼠IgG或与一抗来源相对应的其他同型抗体）作为同型对照，其用量应与特异性探针相当。
      注意：注射对照化合物后获得的体内扫描结果可作为解释特异性探针成像数据的参考依据。
   7. 使用电动剃刀剃除小鼠腹部区域的毛发，以最大限度减少光的反射和吸收。

2. 技术设备

1. 使用小动物荧光成像用的兽用荧光断层成像（FMT）设备（图1）。
2. 通过点击“新建研究”按钮为每个项目创建新研究，并在研究描述中包含相关示踪剂信息，包括成像参数和剂量，以供将来参考。
3. 在该研究中，通过点击“新建研究组”按钮，根据相应研究设计创建研究组（例如，特异性示踪剂组和非特异性同型对照组），并为每个研究组分配相应数量的动物。
4. 对示踪剂构建物进行系统校准。
   1. 对每一批次的示踪剂进行校准，以校正标记效率的差异，从而实现对光学成像（OI）数据的定量测量。
   2. 按照仪器制造商提供的指南对每个独立系统进行校准；选择“添加新示踪剂”后，系统将引导完成后续步骤。需提供所用抗体溶液的稀释倍数以及探针中示踪剂的计算绝对浓度。
   3. 对于FMT，使用具有确定厚度和吸收特性的仿组织模型（模拟活体组织），并注入特定体积的抗体溶液，然后在FMT设备上进行测量。
      注意：系统将结合所提供的探针参考测量值及其给定浓度，用于计算未来体内测量中的示踪剂绝对浓度。
5. 使用可加热的检查盒，温度设置为42 °C。
   注意：这可防止小鼠在检查过程中发生低体温。

3. 动物麻醉

1. 使用1.5–2%体积浓度的异氟烷（[2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷]）与1.5 L/min的氧气，持续气流麻醉₂/min 以麻醉小鼠。使用专为啮齿类动物麻醉设计的吸入式麻醉系统（异氟烷蒸发器），以便轻松控制麻醉深度，并最大限度减少对操作人员的暴露。
2. 将小鼠放入防漏的诱导室中，打开异氟烷蒸发器（100% (v/v)，5% 体积浓度氧气，3 L/min）。持续观察小鼠，直至其侧卧且失去意识。
3. 将其置于断层扫描检查暗盒中，通过鼻罩持续吸入异氟烷，剂量为100% v/v，1.5 vol% 溶于氧气中，流速1.5 L/min，以最大限度减少检查过程中因动物移动产生的伪影。对于持续时间超过5分钟的操作，需在小鼠眼部涂抹眼膏，以防止角膜损伤。
4. 通过检查反射评估麻醉深度。将小鼠仰卧放置；若麻醉充分，小鼠不应翻转体位。轻捏小鼠脚趾间部位；若麻醉充分，其腿部不会回缩（达到外科手术耐受阶段）。

4. 荧光介导断层扫描

注意：根据所使用的替代荧光反射成像设备或FMT系统，调整本研究中所用FMT系统的以下具体细节（参见材料表）。

1. 将麻醉后的小鼠仰卧放置于检查盒中。
2. 执行扫描程序。
   1. 将检查盒插入成像系统，并立即关闭，以确保持续麻醉。从先前创建的研究组中选择相应的样本。从下拉菜单中选择所使用的示踪剂，以确保正确计算示踪剂浓度值。
   2. 在适当波长下（Cyanine7 为 720 nm）获取荧光反射图像用于扫描规划，并通过点击“获取图像”按钮划定扫描区域。
   3. 确认扫描区域作为叠加图像显示在荧光反射图像上。将其调整至目标区域（例如，结肠或腹部），避免包含空气或残留毛发的区域。根据成像目标，在右侧菜单中选择粗略、中等或精细的扫描分辨率，以设定扫描区域内图像数据点的数量。
      注意：请注意，精细扫描分辨率虽可提供更高的空间分辨率，但会显著延长扫描时间。
   4. 点击“扫描”按钮，开始在选定波长下进行数据/图像采集。
      注意：对整个腹部进行中等至精细扫描所需时间约为 5 分钟；在此期间，每个数据点将被激发激光单独照射，并记录所产生的荧光信号。
   5. 扫描结束后，将动物从成像盒中取出，并在放回笼子前确保其完全恢复。
   6. 若实验需要，可在不同时间点重复进行FMT扫描（例如，第 0、5 和 9–10 天（实验结束时）），但需考虑抗体在体内累积可能引起背景荧光信号升高。

5. 数据重建与解读

1. 使用相应成像软件的重建工具，从原始成像数据生成荧光分布的三维图谱；扫描时若选择“添加至重建队列”功能，扫描数据将自动加入重建工具中。
   1. 否则，从相应研究及研究组下方的下拉菜单中选择扫描图像，右键单击该扫描图像，然后选择“添加到重建”。
2. 为进一步分析，将数据集载入分析软件。从顶部工具栏的下拉菜单中选择相应研究，然后从右侧菜单中选择研究组别及具体动物；该动物的所有扫描结果将显示出来。选择正确的扫描图像，然后点击“load”。
   注意： 示踪剂分布的三维重建结果将作为初始获取的荧光反射图像的叠加图显示在左侧。模型可旋转和放大，以便于分析。
3. 识别非特异性标记物聚集的焦点（例如， 肝脏或尿 bladder）在重建的3D图谱上，并与目标组织区分开例如， 肠道
4. 从顶部工具栏中选择最适合目标区域的ROI形状。在分析软件中使用相应的测量工具标记目标组织为感兴趣区域（ROI）；软件将提供该ROI的荧光强度，以及根据扫描校准所得到的示踪剂（皮摩尔）浓度。
5. 选择经ROI大小归一化的感兴趣区域中示踪剂总量，作为评估疾病活动性（与炎症浸润相关，组织学）的最适等效指标。
   注意： 可根据具体模型的特性，选择其他合适的 ROI 特征作为代表性参数。

结果

图 1. 小鼠结肠炎中巨噬细胞浸润的断层成像可视化。

对结肠炎小鼠和非结肠炎对照小鼠（每组 n = 5）注射与 Cyanine7 偶联的抗小鼠 F4/80 抗体后进行 FMT 扫描。（A） 柱状图：在 ROI 中测定的染料总荧光强度（以 pmol 计），以均值 ± 标准误（SEM）表示。代表性图像显示了颜色编码的荧光强度，对应于注射特异性探针（抗小鼠 F4/80）（B） 和非特异性对照（大鼠 IgG）（C） 小鼠中炎性浸润的程度。在这两种情况下，均在上...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
苜蓿-free饲料	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen眼膏	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
葡聚糖硫酸钠（DSS）	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
伊红	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
苏木精	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek包埋剂	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583	组织学分析用固定剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza, Verviers, Belgium	4629
氯化钠 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
碳酸氢钠粉末	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany	S5761
标准饲料	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek冷冻模具	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Hemoccult（愈创木脂试纸检测）	Beckmann Coulter, Germany	3060
生物素标记大鼠抗小鼠F4/80抗体	Serotec, Oxford, UK	MCA497B
生物素标记大鼠抗小鼠GR-1抗体	BD Pharmingen, Heidelberg Germany	553125
链霉亲和素-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Germany	S-11225	激发/发射最大值：556/573 nm
抗CD11b大鼠抗小鼠抗体TC	Calteg, Burlingame, USA	R2b06
纯化抗小鼠F4/80抗体	BioLegend, London, UK	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	D9542
FITC标记抗Ly6C大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	553104
FACS缓冲液	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	342003
Cy7 NHS酯	GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany	K 6631B
Cy5.5标记抗小鼠F4/80抗体	BioLegend, London, UK	123127	即用型标记抗体（替代品）
抗小鼠F4/80抗原PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, USA	45-4801-80	即用型标记抗体（替代品）
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	67-68-5
异氟烷	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	792632
乙醇	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	64-17-5
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	A4612
Tris缓冲盐溶液（TBS）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	SRE0032
设备
FACS Calibur流式细胞仪系统	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
FMT 2000活体成像系统	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1成像分析软件	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	包含于FMT2000中
Leica DMLB荧光显微镜	Leica, 35578 Wetzlar, Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Germany	HD 2070	超声波匀浆器
一次性手术刀片 No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum剪刀 14 cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany	22398330
鲁尔锁扣注射器 5 ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z248010
注射器针头	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z192368
Falcon管 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070