基于肽阵列的器官移植受者抗供体HLA同种抗体检测

摘要

来源：Liu, P.，等。用于检测器官移植中HLA同种抗体的个性化肽阵列。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种用于检测器官移植受者体内抗供体 HLA 同种异体抗体的实验方法。合成肽阵列以代表可能引起抗体介导的器官排斥反应的表位。将该阵列与受者血清孵育，血清中的同种异体抗体将结合其靶向表位。通过化学发光法检测抗体结合情况，从而鉴定引发同种异体抗体反应的供体特异性 HLA 表位。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 定制化芯片布局的设计与制备

1. 生成一个包含肽序列及其相应等位基因分型的电子表格。该阵列包含20行和30列，最多可容纳20×30=600个肽位点。根据步骤1.5中记录的某一供体的肽总数，并结合我们此前尝试过的两个实例的经验，600个位点的阵列可容纳约2个独立移植病例所产生的全部序列。
   1. 合理规划多肽组合在阵列600个点位格式中的排布，以实现最高效的利用。
   2. 如果一个完整阵列可容纳多名受试者，应在第一位供体序列后插入空行，使总行数为30的整数倍（阵列中每行包含30个点位）。
   3. 在第一组序列的最后一个空白行之后，立即粘贴第二个移植病例的整列序列内容。
   4. 重复这些步骤，直至阵列填满，且无法在不超出600个点位的情况下添加更多样本。若底部剩余整行空白行需要填充，请将该空白行“移动”至两组供体样本之间。在样本点之间保留这一较宽间距，有助于在合成完成后更方便地切割膜——见下文步骤2.2。
2. 在阵列布局的背景下编写肽序列程序。SPOT合成仪的程序接受以文本格式输入的序列（每行一个肽序列），该文本格式可直接通过将步骤1.1.4所得电子表格另存为纯文本文件（不含等位基因名称、氨基酸位置的额外列）获得。 等等。).
3. 通过SPOT合成仪进行自动肽阵列合成。整个合成操作详见Kudithipudi 等请注意，Fmoc 合成两个阵列大约需要 4-5 天。

2. 来自单个移植受者时间序列的探针与再探针抗血清。

注意： 600 点膜阵列的尺寸约为 7 cm × 13 cm。合成后，若避光保存，阵列可作为干燥膜在室温下存放至少两年。为延长膜的使用寿命以供重复使用，请避免过度折叠。

1. 用乙醇复水膜阵列，并用Ponceau S染色以观察肽段斑点。
   1. 按照Li优化的逐步程序对带有肽段的膜阵列进行再水化 等.
      1. 将阵列膜浸入20 mL 100%乙醇中。
      2. 加入20 mL蒸馏水以将溶液稀释至50%乙醇，室温孵育15分钟。
      3. 将浸润液更换为40 mL的100%水，重复三次，每次孵育15分钟。
      4. 在适当的缓冲液中清洗， 例如， 20 mL TBST（含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水），每次5分钟，重复三次。
   2. 阵列上合成肽的Ponceau S染色以实现可视化
      1. 将20 mL预配制的Ponceau S溶液直接加入水化后的阵列中，摇动孵育约30秒。
      2. 持续用蒸馏水冲洗膜，以去除背景的丽春红S颜色。在此过程中，可能会显现出红色的肽段斑点。
      3. 小心地在每个样本区域之间切割，将芯片按不同供体分开。标记每张芯片的方向。
2. 预阻断芯片阵列。
   1. 用20 mL含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭膜。该基于牛奶的溶液会进一步褪去Ponceau S染色。多次更换牛奶缓冲液，以获得最清晰的肽段图像。
   2. 出于记录目的，使用手持相机拍摄阵列的Ponceau S染色图像（示例如下）。 图1).
   3. 在4 °C下用5%脱脂牛奶封闭膜过夜，或在室温下封闭2小时，期间持续振荡。
3. 将芯片与移植抗血清共同孵育。
   注意： 需要注意的是，在血清抗体分析中，补体依赖性干扰可能导致一种称为前带现象或钩状效应的现象。为避免此问题，可考虑对血清样本进行可选的预处理步骤，使用乙二胺四乙酸（EDTA）或通过加热灭活处理。
   1. 第二天去除封闭缓冲液，用 20 mL TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将20 µL受体的粗制血清加入20 mL含2.5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，与膜在室温下孵育2–3小时。注意，在此第一轮探针检测中，建议优先使用时间序列中最后一次移植后血清（即可能致敏程度最高的血清）。该做法基于以下假设：序列中较早的样本，特别是移植前时间点的样本，所含异体抗体的种类较少，而异体抗体通常会随着时间推移逐渐产生。通过这种方式，可明确区分不同轮次探针检测之间可能存在的信号“残留”干扰，以及因对移植物产生免疫应答而真实生成的异体抗体反应性。
4. 用 20 mL TBST 洗涤芯片，并与二抗孵育。
   1. 用去离子水清洗膜，每次10分钟，共清洗三次。
   2. 在含1%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，以1:10,000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗孵育，继续孵育2小时。
5. 洗涤并显影印迹膜。
   1. 用TBST洗涤膜，每次10分钟，共洗涤三次。
   2. 使用新配制的5 mL 发光素溶液与5 mL 过氧化物溶液混合液孵育膜1分钟，进行增强化学发光（ECL）显影。
   3. 使用合适的成像仪可视化ECL信号（即， ChemiDoc 成像系统或 Azure C600）
6. 扫描并定量分析印迹。
   1. 保存已显影的图像（图2，下图）并对斑点强度进行定量分析。

3. 比较抗血清在临床时间序列中的反应性。

1. 剥离膜。
   1. 此时，需始终确保膜保持湿润。
   2. 将膜在 20 mL 商业剥离缓冲液中于 37 °C 孵育 20 分钟进行剥离，随后用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。然后使用同一患者在不同时间点采集的另一种血清，重复封闭（步骤 3.2）和探针杂交（步骤 3.3）步骤。
2. 封闭已剥离的膜。
   注意：剥离后，该膜可用于同一患者在不同时间点采集的另一种血清的再次检测。
   1. 使用 5% 脱脂奶粉缓冲液进行封闭，方法同前（见步骤 2.2）。
3. 使用同一时间序列中的另一种抗血清重新杂交（重复步骤 2.3–2.6；示例见图 2上图）。
   注意：剥离后的芯片可用于再次检测另一份血清样本。由于多肽已共价连接至膜的支撑基质上，我们已证实该芯片可重复进行多达 20 次的剥离与重新杂交循环，而不会损失其性能。

结果

图1. 使用Ponceau S染色的微阵列区域图像

颜色强度的差异是由于不同肽段的氨基酸组成不同所致，而所有点样区域的肽段浓度均相同。（该图像为示意图，非本研究实际结果图像。）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肽阵列	INTAVIS Bioanalytical Instruments
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
丽春红S溶液	Sigma-Aldrich	P7170
脱脂奶粉	Bio Rad Laboratories	1706404
TBST	Santa Cruz Biotechnology	10711454001
山羊抗人IgG-HRP	ThermoFisher Scientific	A18811
Clarity Western ECL底物	Bio Rad Laboratories	1705061
Restore Western Blot stripping缓冲液	Thermo Scientifics	21059
ChemiDoc凝胶成像系统	Bio Rad Laboratories	1708265