利用打印的聚糖芯片检测循环抗聚糖抗体

摘要

来源：Olivera-Ardid, S. 等，打印式聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了用于分析小鼠血清中循环抗糖抗体的打印糖阵列技术。血清中的抗体与芯片上的特定糖类发生相互作用，通过免疫染色后进行荧光扫描来确认该相互作用。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 糖芯片制备

1. 糖芯片制备
   1. 使用非接触式机器人点样仪，将糖类（50 mM）和多糖（10 µg/mL）以约900 pL的液滴体积，在N-羟基琥珀酰亚胺修饰的玻璃载片上，以300 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.5）为溶液，每种样品点样6次重复。每张载片包含4个不同的子阵列区块（图1A，以不同颜色表示），重复6次。每个子阵列由112种不同的糖类点样组成，包括对照（8行×14列）（图1B）。
      注意：糖类相关信息见表1。用于打印微芯片的糖类文库是IBCh团队长期合成工作的成果；相关合成示例见已发表的文献。该糖类文库包括血型抗原、最常见的末端寡糖、哺乳动物N-和O-连接糖蛋白及糖脂的核心结构、肿瘤相关糖抗原，以及来自病原菌的多糖。
   2. 将载片置于湿度箱中（相对湿度约70%），在室温（25 °C）下孵育1小时。
   3. 封闭糖芯片：在室温下用封闭缓冲液孵育载片1.5小时（100 mM硼酸，25 mM乙醇胺，0.2% (v/v) Tween-20，溶于超纯水中）。
   4. 用超纯水清洗糖芯片，并通过空气干燥。
2. 糖芯片质量控制
   1. 从每批制备的芯片中选取两张，使用1 mg/mL的复合免疫球蛋白制剂溶液（CIP，包含免疫球蛋白IgG、IgM和IgA）、10 µg/mL的生物素化山羊抗人免疫球蛋白溶液作为二抗（IgM + IgG + IgA），以及1 µg/mL的相应荧光标记链霉亲和素偶联物溶液进行分析（具体操作见下文步骤2所述方案）。
   2. 扫描并分析糖芯片（见步骤3，糖阵列分析）。
   3. 选择芯片内和芯片间相关性高于0.9的批次用于后续实验。

2. 聚糖芯片技术

1. 配制以下水溶液（使用超纯水），并在室温（25 °C）下保存：​
   1. 缓冲液-1：含 1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS），含 1% (v/v) Tween-20 和 0.01% (w/v) 叠氮化钠（NaN₃）。
   2. 缓冲液-2：含 1% (w/v) BSA 的 PBS，含 0.1% (v/v) Tween-20 和 0.01% (w/v) NaN₃。
   3. 缓冲液-3：含 0.1% (v/v) Tween-20 的 PBS。
   4. 缓冲液-4：含 0.001% (v/v) Tween-20 的 PBS。
2. 糖芯片与样品准备
   1. 将装有载玻片的储存盒置于实验台上，待其升至室温（25 °C）。
      注意：使用无粉乳胶手套。操作糖芯片时应握住玻璃载玻片底部（即条形码所在位置）。条形码有助于识别正确的一面，避免接触印有糖链的表面。
   2. 打开盒子，取出糖芯片并放入已预先放置湿润滤纸以维持恒定湿度的孵育室（25 °C）中。
   3. 同时，在 1.5 mL 离心管中用缓冲液-1 按 1:20 比例稀释小鼠血清。使用涡旋混合器均质化血清溶液（5 秒）。
      注意：覆盖单个糖芯片表面所需的体积约为 1 mL。
   4. 均质化后，将稀释后的血清在 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，以防止免疫球蛋白聚集。在 10,000 × g 和 25 °C 条件下离心 3 分钟，收集上清液，并弃去任何沉淀物。
   5. 小心地将糖芯片放入孵育室中。加入 1 mL 缓冲液-3，在 25 °C 下孵育 15 分钟，以去除糖芯片表面残留的任何物质。
   6. 将糖芯片垂直持握，使用塑料巴斯德吸管滴加少量缓冲液-3 进行重洗。用滤纸小心吸除糖芯片表面的缓冲液。

3. 反应：抗体结合

1. 将糖芯片放入孵育室中。使用微量移液器将稀释后的血清样本均匀覆盖在糖芯片表面。在37 °C条件下以30 rpm转速振荡孵育1.5小时。用移液器吸头确保糖芯片表面所有干燥区域均被稀释的血清样本覆盖。
2. 去除多余样本，将糖芯片浸入25 °C的Buffer-3中5分钟。随后将糖芯片转移至盛有Buffer-4的容器中（5分钟），最后用超纯水洗涤糖芯片（5分钟）。在175 × g离心力下于25 °C离心1分钟，以去除残留液体。

4. 检测：二抗

1. 将糖芯片放入孵育室中。在糖芯片表面加入山羊抗小鼠（IgG + IgM）生物素标记物的溶液（5 µg/mL，溶于Buffer-2中）。在37 °C下以30 rpm轨道振荡孵育1小时。
2. 去除未结合组分，并重复洗涤步骤。
3. 离心后，在避光条件下，将糖芯片与相应荧光染料标记的链霉亲和素溶液（2 µg/mL，溶于Buffer-2中）在25 °C下孵育45分钟（30 rpm）。
4. 在避光条件下，去除未结合组分，并重复洗涤步骤。
5. 将糖芯片自然晾干。
   注意：糖芯片应尽快进行扫描。但如果染色后无法立即扫描，可将糖芯片置于阴凉干燥处避光保存。

3. 糖芯片阵列分析

1. 扫描芯片
   1. 将糖芯片置于暗处桌面上，待其恢复至室温。同时，打开切片扫描仪和激光（激发波长为 633 nm）。
   2. 手持微阵列，将糖芯片滑入插槽，直至其接触后壁。
   3. 扫描糖芯片（“运行快速扫描”），并将扫描结果保存为“.TIFF”文件。

表1：糖链列表，及其与BALB/c小鼠（n = 20）天然循环抗体（IgM + IgG）的结合情况，以相对荧光单位（RFU）表示，数据为中位数 ± MAD，以及超过截断值（≥4000 RFU）的动物数量。本表格摘自 Bello-Gil, D. et al. 请点击此处下载该表格。

结果

图1：糖芯片的配置、点样与分析流程示意图（未按比例绘制）。（A）打印的微芯片包含由419种不同糖结构组成的文库，随后使用适当的荧光标记二抗进行检测。每张芯片包含4个不同的亚阵列区块（以不同颜色表示），每个区块重复6次。每个亚阵列由112个不同的糖点（8行 × 14列）组成，包括对照点。（B）使用荧光扫描仪对微芯片扫描后获得图像的代表性示例（图像右下部分）。（C）将“网格”与每个亚阵列中的点位对齐的过程（定量过程中的模板调整）。（D）检测每个点的荧光信号，并将结果导入通用的电子表格文件中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
生物素标记的山羊抗人免疫球蛋白	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Ref. #: 31782
生物素标记的山羊抗小鼠 IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	Ref. #: 31807
设备
sciFLEXARRAYER S5 机器人点样仪	Scienion AG, Berlin, Germany	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
染色盒（载玻片孵育室）	Simport, Beloeil, QC, Canada	Ref. #: M920-2
离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany	Ref. #: 5810 R
移液器	Gilson, Middleton, WI, USA	http://www.gilson.com/en/Pipette/
载玻片扫描仪	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	ScanArray GX Plus
摇床孵育器	Cole-Parmer, Staffordshire, UK	Ref. #: SI50
生物样本
BALB/c 小鼠血清	本文	N/A
复合免疫球蛋白制剂（CIP）	Immuno-Gem, Moscow, Russia	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
化学品、试剂和糖类
糖类文库	俄罗斯莫斯科生物有机化学研究所（IBCh）	N/A
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Ref. #: A9418
乙醇胺	Sigma-Aldrich	Ref. #: 411000
Tween-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain	Ref. #: 655204
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain	Ref. #: E404
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	Ref. #: S2002
链霉亲和素 Alexa Fluor 555 偶联物	Thermo Fisher Scientific	Ref. #: S21381
链霉亲和素 Cy5 偶联物	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK	Ref. #: PA45001
材料
N-羟基琥珀酰亚胺衍生物修饰的玻璃载片 H	Schott-Nexterion, Jena, Germany	Ref. #: 1070936
Whatman 滤纸	Sigma-Aldrich	Ref. #: WHA10347509
1.5 mL 离心管	Eppendorf	Ref. #: 0030120086
软件与算法
ScanArray Express 微阵列分析系统	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray