用于抗体特异性分析的肽微阵列技术

1. 设计阵列幻灯片和源板布局

1. 在 ArrayNinja 界面上的"规划幻灯片布局"标题下，单击与正在使用的微阵列打印机相对应的链接。
   注意:ArrayNinja 已被编程为模拟两种常用微阵列打印机的机器人运动（见表 1）。可根据要求配置与其他阵列仪的兼容性。
2. 在"Load plate"对话框中单击，键入"empty"，然后单击"enter"。参见图 1 以获取 ArrayNinja 设计模块的屏幕截图。
3. 将光斑直径调整为 275 μm，光斑间距为 375 μm。调整其余设置（板块/板行、板总行、重复、y 中的特征、超级阵列、SuperA 软糖;参见图 1）以自定义特征在微阵列切片上的显示方式。
   注意:光斑直径由微阵列针的大小决定。随着这些设置的调整，卡通幻灯片将实时更新。使用此卡通可预览每个设置如何修改最终的幻灯片版式。
4. 在完成幻灯片上的功能布局后，将鼠标悬停在每个唯一功能上，然后在弹出对话框中输入功能标识符。
   注意:特征标识符可以由数字、字母或组合组成。这仅对唯一要素是必需的，并且在选择复制时不会显示对话框。
5. 为所有独特功能分配标识符后，单击"填充"。输入幻灯片布局的名称，然后单击"打印您的板"以保存。将打开一个新页面，显示制造所选玻片设计所需的 384 孔源板的数量，以及一个表格，该表格映射了要加载到源板中的每个特征的物理位置><。 注意:记住这个名字，因为它将用于在分析微阵列数据时调用这个设计。单击 'print your plate' 将保存 ArrayNinja 中的布局。

2. 制作微阵列芯片

1. 准备源板
   1. 使用通过 ArrayNinja 生成的映射创建 384 孔源板><。 注:在此平台上查询的肽的详细说明可在其他位置找到。
   2. 将 1 - 2 μL 的每种特征（例如，生物素化组蛋白肽）沉积到 384 孔源板的正确孔中><。 注意:生物素化组蛋白肽通常沉积在 200 - 400 μM 储备液中，这相当于在单个阵列点中肽与链霉亲和素结合位点的 10 至 25 摩尔过量。这是使用以下公式计算的:
      
      其中 V 是引脚传递的体积，[P] 是正在打印的特征的浓度，NA 是阿伏加德罗数，S 是光斑的表面积。C 是玻片的覆盖率，表示为每单位面积的链霉亲和素分子数乘以 3（可用链霉亲和素结合位点的平均数）。V 和 C 由各自的制造商获得。其他特征可能需要不同的浓度，具体取决于生物分子的大小，其中可能会引起拥挤。应凭经验测试每种新特征的打印浓度范围，以确定最佳打印浓度。
   3. 用补充有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 1x 打印缓冲液将每个特征稀释 10 倍。在室温下以 500 x g 离心源板 2 分钟><。 注意: 建议在打印缓冲液中加入荧光素标记的生物素 （5 μg/μL） 作为点样对照和视觉辅助工具，以促进分析过程中正确的阵列对齐（参见图 3）。
2. 打印协议（图 2A – B）。
   1. 通过清空废物收集容器并用无菌蒸馏水填充洗涤液容器和加湿器容器来准备阵列器。
   2. 将用于在 ArrayNinja 中设计玻片的参数（图 1）输入到微阵列打印机控制程序中。
   3. 使用微阵列打印机控制程序，将洗涤程序设置为一次浸泡 1 秒洗涤。设置洗涤后设置，在每次洗涤后重新浸入引脚 5 次。将湿度设置为 60><%。 注意: 最佳洗涤配置可能因所使用的微阵列打印机而异。最佳的清洗后针浸渍配置可能因所使用的微阵列打印机而异。
   4. 将功能化载玻片（例如，链霉亲和素涂层玻璃）插入基板压板，并将所有压板放入压板升降器中。将源板插入板支架中，然后放入源板升降器中。
   5. 点击"打印"。监控打印过程的几轮特征沉积，以确保所有清洗和浸渍设置正确。打印运行完成后，从阵列器中取出基板压板。
      注意:当大打印次数无法在一天内完成封闭步骤时，打印的玻片可以在 4 °C 的加湿室中孵育过夜。将载玻片放在用保鲜膜密封的纸板箱内的一个小烧杯旁边孵育。
   6. 在室温下用封闭缓冲液封闭载玻片 30 分钟并混合。
   7. 在室温下在 pH 7.6 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中洗涤载玻片 2 x 10 分钟，并混合。通过在微阵列载玻片离心机中在室温下旋转 30 秒来干燥载玻片><。 注意:为了一次处理大量玻片，可以使用高通量显微镜玻片清洗室，允许同时清洗 50 张玻片。
   8. 对于设计为用蜡分隔的玻片，请继续执行第 2.1 节。对于所有其他设计，请将玻片存放在 4 °C 下，避光避湿><。 注意: 以这种方式储存时，打印的生物素化组蛋白肽可稳定保存至少 6 个月。

2. 对微阵列芯片玻片进行分区

1. 疏水蜡笔（图 2C）
   1. 使用蜡笔在包含特征的区域周围涂抹蜡。让蜡风干 5 分钟，然后继续进行第 3.
      节 注意:阻塞后，阵列点可能很难用肉眼看到。ArrayNinja 的幻灯片设计可以按比例打印并用作涂蜡的指南。
2. 硅垫圈（图 2D）
   1. 撕下阵列垫圈背面的透明薄膜，将粘合面朝下放在微阵列载玻片上。
   将
   2. 垫圈固定 5 秒，然后再进行第 3 部分。
3. 蜡印记（图 2E）
   1. 对于设计为用蜡分隔的玻片，请使用 10% BSA 在普通玻璃上打印测试玻片。使用此测试玻片优化蜡印记指南或阵列设置，以确保所有特征都在蜡模腔室内。
   2. 将微阵列蜡印迹机加热至85°C，直到所有蜡完全熔化，大约需要30分钟。
   3. 插入载玻片，打印面朝下，然后将载玻片一直推到微阵列打印机上的右侧导轨。拉起拉杆，使模具与滑块表面接触。保持 2 s.
      注意: 可以改变保持时间以获得最佳蜡质边框厚度。
   4. 快速取下玻片并目视检查蜡质边界，以确保所有孔都封闭，并且边界不会太厚以至于侵占斑点。将玻片储存在 4 °C 下，避免潮湿和避光><。 注意: 可以增加或减少保持时间以获得更厚或更细的边框。

3. 组蛋白 PTM 抗体与肽微阵列杂交

1. 准备杂交缓冲液（PBS，pH 7.6,5% BSA，0.1% Tween-20）。
2. 使用杂交容器在杂交缓冲液中平衡载玻片。在杂交缓冲液中完全覆盖整个玻片，并在 4 °C 下在轨道振荡器上低速孵育 30 分钟。
3. 在杂交缓冲液中制备含有稀释组蛋白 PTM 抗体的溶液。
   注意:在示例数据中，组蛋白抗体 #1 和抗体 #2 均在杂交缓冲液中以 1:1,000 稀释。建议将类似于免疫印迹的稀释范围作为起点。
4. 将阵列与抗体溶液在 4 °C 下孵育 1 小时。取出抗体溶液，并在 4 °C 下用冷 PBS（pH 7.6）洗涤阵列 3 次，每次 5 分钟。
5. 在杂交缓冲液中制备 1:5,000 - 1:10,000 稀释的荧光染料偶联二抗。
6. 将阵列与二抗溶液在 4°C 避光孵育 30 分钟。取出二抗溶液，并在 4 °C 下用 PBS（pH 7.6）洗涤微阵列玻片 3 次，每次 5 分钟。在室温下将微阵列芯片浸入含有 0.1x PBS、pH 值为 7.6 的 50 mL 锥形管中，以去除多余的盐。在室温下在微阵列载玻片离心机中干燥载玻片。
7. 按照微阵列芯片扫描仪制造商推荐的扫描方案，使用 25 μm 或更高分辨率的微阵列芯片扫描仪扫描玻片><。 注意: 如果存在荧光素标记的生物素示踪剂，则扫描绿色通道（例如:488 nm，em:509 nm）和对应于荧光染料偶联二抗的通道，通常为红色（例如:635 nm，em:677 nm）。扫描的目标是获取可合并为单个 .png 文件的单通道 .tif 文件。

图 1:ArrayNinja Design 模块。 虚线中显示了 ArrayNinja 设计模块的屏幕截图。控制面板（顶部）显示了可在微阵列打印机上更改的所有参数。调整这些参数时，幻灯片版式的卡通图像（左下角）会实时更新。设置布局后，用户可以将鼠标悬停在各个点上以输入唯一特征标识符。ArrayNinja 从该用户输入构建指定微阵列玻片布局所需的源板（右下角）中每个特征的位置图。

图 2:微阵列制造。 （A） 使用接触式微阵列打印机在链霉亲和素包被的显微镜载玻片上制备组蛋白肽微阵列。（B） 用 48 x 48 肽特征网格的 3 个子阵列构建的微阵列芯片。用疏水蜡笔分离 （C） 3 个子阵列，（D） 用硅粘合剂分离 2 个子阵列，以及 （E） 用蜡印分离 48 个子阵列。所示的所有微阵列均使用 25 x 75 mm 显微镜载玻片制备。

图 3:ArrayNinja 分析模块。显示了 ArrayNinja 分析模块的屏幕截图。控制面板（左上方）显示了所有可以调整的参数，以可视化阵列、查找点并在阵列图像上对齐网格。将鼠标悬停在要素上将显示放大视图（右上角），并显示一个弹出窗口，其中包含与该要素关联的标识信息（底部）。选择用于背景校正的参考点为橙色。要从下游分析中排除的特征为白色。ArrayNinja 包含一个基于文本的搜索功能，该功能以黄色突出显示匹配的特征，如 H4K16 的示例所示。