一种用于抗体特异性分析的多肽微阵列技术

摘要

来源：Cornett, E. M.，等。利用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种应用多肽微阵列技术来分析识别组蛋白多肽上翻译后修饰（PTM）的抗体特异性的方法。将含有已知PTM组合的固定化荧光染料标记组蛋白多肽的微阵列芯片与靶向PTM特异性抗体孵育。该过程有助于确定抗体对靶标PTM的特异性及其与非靶标PTM之间潜在的交叉反应性。

方案

1. 设计芯片阵列和来源板布局

1. 在 ArrayNinja 界面的“规划芯片布局”标题下，点击与所用微阵列打印机相对应的链接。
   注意：ArrayNinja 已被编程以模拟两种常用微阵列打印机的机器人运动（见表1）。可根据要求配置与其他阵列仪的兼容性。
2. 点击“加载板”对话框内部，输入“empty”，然后点击“回车”。微阵列设计模块的截图参见图1。
3. 将点样直径调整为 275 µm，点样间距调整为 375 µm。调整其余设置（板区块/板行、总板行数、重复次数、y方向特征数、超级阵列、SuperA fudge；参见图1），以自定义特征在微阵列芯片上的排列方式。
   注意：点样直径由微阵列针的尺寸决定。当这些设置被调整时，示意图芯片将实时更新。请使用该示意图预览每个设置如何影响最终的芯片布局。
4. 在芯片上特征的布局确定后，将鼠标悬停于每个独特特征上，并在弹出的对话框中输入特征标识符。
   注意：特征标识符可由数字、字母或其组合构成。此操作仅针对独特特征必需；当选中重复特征时，不会出现对话框。
5. 在所有独特特征均被分配标识符后，点击“填充”。为芯片布局输入名称，然后点击“打印您的板”以保存。新页面将打开，显示制造所选芯片设计所需的 384 孔源板数量，以及将每个特征加载至源板的物理位置映射表。
   注意：请记住此名称，因为在分析微阵列数据时将使用该名称调用此设计。“打印您的板”操作会将布局保存在 ArrayNinja 中。

2. 制备微阵列

1. 准备源板
   1. 使用 ArrayNinja 生成的图谱制备 384 孔源板。
      ​注意： 有关该平台上查询的肽的详细描述可参见其他文献。
   2. 每次特征点加样 1 - 2 µL例如，将生物素化组蛋白肽）加入至384孔源板的正确孔中。
      注意： 生物素化组蛋白多肽通常从 200 - 400 µM 的储存液中点样，相当于每单个芯片点中多肽相对于链霉亲和素结合位点的摩尔过量倍数为 10 至 25 倍。该数值通过以下公式计算得出：
      
      其中 V 是移液针所传递的体积，[P] 是所打印特征的浓度， NA 是阿伏伽德罗常数，以及 S 是一个斑点的表面积。 C 即载玻片的覆盖度，表示为每单位面积的链霉亲和素分子数乘以三（链霉亲和素结合位点的平均数量）。 V 和 C 由相应制造商提供。其他特征可能需要根据生物分子的大小调整不同浓度，因为分子拥挤可能成为影响因素。每种新类型特征的打印浓度范围都应通过实验测试，以确定最佳打印浓度。
   3. 将每种组分用含1%牛血清白蛋白（BSA）的1×打印缓冲液稀释10倍。在室温下，以500 × g离心源板1-2分钟。
      注意： 建议在打印缓冲液中加入荧光素标记的生物素（5 µg/µL），作为点样对照，并在分析过程中作为可视化辅助手段，以帮助实现正确的芯片阵列对齐（参见 图3).
2. 打印方案（图2A–B).
   1. 清空废液收集容器，并向清洗液容器和加湿器容器中加入无菌蒸馏水，以准备阵列仪。
   2. 输入在 ArrayNinja 中设计芯片所使用的参数（图1) 导入微阵列打印机控制程序。
   3. 使用微阵列打印机控制程序，设置清洗程序为浸入式清洗1次，每次清洗持续1秒。设置清洗后步骤为每次清洗结束后重新浸入探针5次。将湿度设置为60%。
      注意： 最佳洗涤配置可能因所使用的微阵列打印机而异。洗涤后探针浸入配置的最佳参数可能因所使用的微阵列打印机而异。
   4. 插入功能化载玻片（例如，将链霉亲和素包被的玻璃片插入底物压板中，并将所有压板放入压板升降器内。将源板插入板架中，并置于源板升降器内。
   5. 点击“打印”。监控打印过程数个特征沉积循环，以确保所有清洗和浸润设置正确。打印完成后，从点样仪上取下基底板。
      注意： 当大批量打印任务导致无法在一天内完成封闭步骤时，可将打印好的载玻片置于加湿孵育盒中，在 4 °C 下过夜孵育。将载玻片与一个小烧杯盛装的水一同放置于纸箱内，并用塑料膜密封纸箱。
   6. 用封闭缓冲液在室温下振荡孵育30分钟以封闭载玻片。
   7. 在室温下，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.6）洗涤载玻片，每次10分钟，共洗两次，期间保持混匀。将载玻片置于微阵列载玻片离心机中，室温离心30秒，使其干燥。
      注意： 对于一次性处理大量载玻片，可使用高通量显微镜载玻片清洗槽，可同时清洗50张载玻片。
   8. 对于设计用于蜡分割的载玻片，进入第2.1节。对于所有其他设计，将载玻片置于4 °C避光防潮保存。
      注意： 打印的生物素化组蛋白肽以此方式储存时，至少可保持稳定6个月。

2. 芯片玻片的分区

1. 疏水性蜡笔（图2C）
   1. 使用蜡笔在含有微阵列特征的区域周围涂抹蜡。涂抹后静置晾干5分钟，再进入第3节操作。
      注意： 封闭后，阵列点可能肉眼难以观察。可按实际比例打印ArrayNinja提供的载玻片设计图，作为涂抹蜡时的参考指南。
2. 硅胶垫圈（图2D）
   1. 将阵列垫圈背面的透明保护膜撕下，使粘性面朝下贴附到微阵列载玻片上。
   2. 固定垫圈位置，保持5秒，然后进入第3节操作。
3. 蜡印成型（图2E）
   1. 对于设计为蜡分隔的载玻片，可先在普通玻片上用10% BSA打印测试片。利用该测试片优化蜡印成型仪的导板或阵列设置，确保所有特征均位于蜡模腔体内。
   2. 将微阵列蜡印成型仪加热至85 °C，直至蜡完全熔化，约需30分钟。
   3. 将打印面朝下的载玻片插入成型仪中，并将其完全推至右侧导板位置。抬起手柄，使模具与载玻片表面接触，保持2秒。
      注意： 可调整保持时间以获得最佳的蜡边厚度。
   4. 迅速取出载玻片，目视检查蜡边，确保所有孔位均被封闭，且蜡边厚度适中，不侵占阵列点区域。将载玻片置于4 °C环境中，避光防潮保存。
      注意： 可通过增加或减少保持时间来获得更厚或更薄的蜡边。

3. 组蛋白PTM抗体与肽段微阵列的杂交

1. 配制杂交缓冲液（PBS，pH 7.6，5% BSA，0.1% Tween-20）。
2. 使用杂交容器将载玻片在杂交缓冲液中平衡。用杂交缓冲液完全覆盖整个载玻片，并在4 °C、低速振荡条件下孵育30分钟。
3. 在杂交缓冲液中配制稀释的组蛋白PTM抗体溶液。
   注意：在示例数据中，组蛋白抗体#1和抗体#2均以1:1,000的比例稀释于杂交缓冲液中。建议以与免疫印迹实验相似的稀释范围作为起始点。
4. 将芯片与抗体溶液在4 °C孵育1小时。移除抗体溶液后，用预冷的PBS（pH 7.6）在4 °C下洗涤芯片3次，每次5分钟。
5. 在杂交缓冲液中配制1:5,000至1:10,000稀释度的荧光染料标记二抗溶液。
6. 将芯片与二抗溶液在4 °C避光孵育30分钟。移除二抗溶液后，用PBS（pH 7.6）在4 °C下洗涤微阵列载玻片3次，每次5分钟。将微阵列浸入含有0.1x PBS（pH 7.6）的50 mL圆底管中，于室温下洗去多余盐分。随后在室温下使用微阵列载玻片离心机干燥载玻片。
7. 按照微阵列扫描仪制造商推荐的扫描程序，以25 µm或更高分辨率对载玻片进行扫描。
   注意：若存在荧光素标记的生物素示踪剂，需同时扫描绿色通道（激发：488 nm，发射：509 nm）和对应于荧光染料标记二抗的通道（通常为红色通道，激发：635 nm，发射：677 nm）。扫描的目标是获得可合并为单一.png文件的单通道.tif文件。

结果

图1：ArrayNinja设计模块。 虚线框内显示的是ArrayNinja设计模块的截图。控制面板（顶部）展示了可在微阵列打印机上调整的所有参数。随着这些参数的调整，载玻片布局的示意图（左下）会实时更新。布局设定完成后，用户可通过鼠标悬停在各个点位上，输入唯一的特征标识符。ArrayNinja根据用户的输入，生成所需微阵列载玻片布局中每个特征在源板（右下）中的位置图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
打印缓冲液	ArrayIt	PPB
牛血清白蛋白	Omnipure	2390
链霉亲和素包被的玻璃显微镜载片	Greiner Bio-one	439003-25
聚丙烯 384 孔板	Greiner Bio-one	784201
生物素-荧光素	Sigma	53608
接触式微阵列打印机	Aushon	2470	Aushon 2470 微阵列打印机
接触式微阵列打印机	Gene Machines	OmniGrid 100	OmniGrid 微阵列打印机
磷酸盐缓冲液	Invitrogen	14190
封闭缓冲液	ArrayIt	SBB
疏水性蜡笔	Vector Labs	H-4000	ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔
硅胶垫片	Grace Bio-labs	622511
杂交容器	Thermo Scientific	267061	或类似容器
荧光染料偶联的二抗	Life Technologies	A-21244	Alexa Fluor 647（抗兔）
荧光染料偶联的二抗	Life Technologies	A-21235	Alexa Fluor 647（抗小鼠）
蜡印仪	ArrayIt	MSI48
吐温-20	Omnipure	9490
微阵列扫描仪	Innopsys	InnoScan 1100AL	或同等性能的微阵列扫描仪
EipTitan 组蛋白肽微阵列	Epicypher	112001
AbSurance Pro 组蛋白肽微阵列	Millipore	16668
MODified 组蛋白肽阵列	Active Motif	13001
组蛋白密码肽微阵列	JPT	His_MA_01
蜡	Royal Oak	GulfWax	用于蜡印仪
加湿型微阵列载片杂交室	VWR	97000-284
高通量显微镜载片洗涤槽	ArrayIt	HTW
显微镜载片离心机	VWR	93000-204
抗体 1	Abcam	8898
抗体 2	Millipore	07-473
生物素化组蛋白肽	EpiCypher	12-2001	示例肽。具有不同修饰的类似肽可从多家商业来源获得。
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/