一种用于成像斑马鱼放射状胶质前体细胞中 Notch/DeltaD 信号通路的抗体摄取检测方法

摘要

来源：Zhao, X. 等，利用抗体摄取实验追踪斑马鱼放射状胶质前体细胞不对称分裂过程中的 Notch/Delta 内吞作用。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了一种抗体摄取实验，用于对斑马鱼放射状胶质前体细胞中的 Notch/DeltaD 信号进行成像。该方法包括将去壳并包埋于琼脂糖中的斑马鱼胚胎进行固定，向其中注射靶向 RGP 上 DeltaD 配体的染料溶液，并在荧光显微镜下观察，以确认 Notch/DeltaD 信号通路的激活及不对称细胞分裂现象。

方案

1. 斑马鱼胚胎的制备

1. 在当天下午5:00前设置鱼类交配缸，每个缸中放入一条野生型雌鱼和一条Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 雄鱼，并使用隔离板将它们分隔开。
2. 次日上午11:00前，从所有交配缸中移除隔离板。保持安静，避免干扰鱼类交配。产卵通常在移除隔离板后30分钟内发生，受精卵会留在缸底。
   1. 使用网筛从缸中收集受精卵，通过冲洗将卵转移至盛有卵水的培养皿中，并在解剖显微镜下以10倍至20倍放大倍数观察胚胎。
3. 使用大口径玻璃巴斯德吸管将受精胚胎转移至含有约20 mL胚胎培养基的洁净培养皿中（1,000倍储备液每100 mL含氯化钠（NaCl）29.4 g、氯化钾（KCl）1.27 g、二水氯化钙（CaCl₂.2H₂O）4.85 g和七水硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）8.13 g）。将胚胎置于28 °C环境中培养。每30 mL胚胎培养基中放置50个受精胚胎，培养温度为28.5 °C。
   ​注意：一对鱼类通常可产生100–300个胚胎，每次交配的受精率和健康胚胎存活率均超过95%。
4. 次日上午8:00从培养箱中取出胚胎，此时胚胎已发育至受精后约18–20小时（hpf）的阶段。先使用白光在落射荧光显微镜下以20倍放大倍数观察。此时斑马鱼胚胎处于20体节期。
   1. 在显微镜下使用玻璃吸管剔除浑浊或破裂的死亡胚胎。
5. 打开荧光灯，选择显微镜的红色荧光蛋白（RFP）滤光片设置，挑选出红色荧光强烈的胚胎，并将其转移至盛有卵水的新培养皿中。
   1. 在白光下使用两把精细镊子（镊子尖端应锋利且无损伤）手动去除胚胎的绒毛膜（见材料表）。
   2. 用一把镊子夹住绒毛膜，另一把镊子在其上撕开一个小口，再小心地用镊子扩大裂口，并轻轻推动胚胎，使其从裂口处通过。
6. 将去绒毛膜的胚胎转移至盛有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，短暂清洗后准备进行显微注射。

2. 显微注射的准备

1. 使用毛细管（外径（OD）1.2 mm，内径（ID）0.9 mm，带纤维）在拉针仪上制备精细注射针。根据仪器手册设计并优化拉针程序。
2. 在体视解剖显微镜下用镊子打开针尖，使针尖直径约为 10 µm，锥角约为 30°。
3. 在注射前将小鼠单克隆抗-Dld 抗体与抗小鼠 IgG-Atto647N 进行偶联。
   1. 每次注射实验中，用移液器反复吹打 5–10 次，将 0.5 µL 抗-Dld 抗体（0.5 mg/mL）与 2 µL 抗小鼠 IgG-Atto647N 抗体（1 mg/mL）混合。然后在室温下孵育至少 30 分钟（或在冰上孵育 2–3 小时）。
   2. 孵育后，在抗体混合物中加入 2.5 µL 封闭缓冲液（10 mg/mL 小鼠 IgG）和 0.5 µL 0.5% 酚红，吹打 10 次以充分混匀，封闭混合物中残留的未偶联抗体。
      注意：每次实验需额外配制一份不含抗-Dld 抗体的混合液，作为对照使用。
4. 在胚胎培养基中配制 1% 低熔点琼脂糖。将含琼脂糖的混合物在 70 °C 加热至透明。
   1. 将琼脂糖溶液分装至 2 mL 微离心管中，置于约 40 °C 的加热块中保温。
5. 将胚胎在含有 1% 低熔点琼脂糖的管中冲洗 3 秒。
6. 将胚胎与单独的琼脂糖液滴（约 30–40 µL）一起放置于倒置的塑料培养皿盖上，如图 1所示，将每个胚胎单独固定在盖上。使胚胎在琼脂糖中呈侧卧平放状态，并保持该位置直至琼脂糖在室温下凝固。
7. 按上述方法逐个将 12 个胚胎以三行排列固定。用卵培养基覆盖所有固定在琼脂糖中的胚胎。

3. 显微注射

1. 将包埋的胚胎置于体视显微镜下，并用胚胎培养液覆盖琼脂糖。
2. 设置气压注射仪并连接显微操作器，将其放置在显微镜附近，如图1所示。使用装有高压氮气（N₂）的钢制气瓶作为气源。
   1. 待胚胎在琼脂糖中固定好后，再打开气体阀门。使用显微注射仪的前端加样模块时，如图1所示，将2 µL抗体混合液从前端加载至准备好的玻璃针尖中。
   2. 调节输入压力至约80–90 psi，注射压力至约20 psi。
3. 按照前述方法，在显微镜下使用微米尺校准注射体积。根据针尖开口大小，将调节时间设定为10 ms至120 ms。通过轻按脚踏开关释放每次注射脉冲，调节每次注射体积至约4–5 nL。
4. 将显微注射针尖刺穿位于r0/r1铰链点后方的后脑背侧顶板，注入约10 nL（两到三次脉冲）抗体混合液，避免触碰脑组织。观察红色液体在脑室内的流动情况。
   注意：后脑室位于中脑-后脑边界后方。含有酚红的抗体混合液会随脑脊液迅速扩散，立即充满从后脑至前脑的整个脑室系统。
5. 注射完成后，通过旋转显微操作器的旋钮迅速将针尖从胚胎中撤出。成功的注射应使注射液中的红色染料稳定保留在脑室内，不向周围琼脂糖中泄漏。
6. 移动载片板至显微镜下，定位下一个已固定的胚胎，以便重复操作。
   1. 每注射六至八个胚胎后，使用显微外科刀剥离琼脂糖，释放包埋其中的胚胎。将显微注射后的胚胎转移至含30 mL新鲜胚胎培养基的新培养皿中，并于室温下放置，用于后续实验步骤。

4. 样品固定与活细胞延时成像

1. 30 分钟后，将选定的胚胎转移至 10 mL 胚胎培养基中。向 10 mL 胚胎培养基中加入 420 µL 三卡因储备液（4 mg/mL），以麻醉胚胎。
2. 为固定胚胎，准备含有相同浓度三卡因的 0.8% 低熔点琼脂糖溶液于离心管中，并将分装样品置于约 40 °C 的加热块中保温。
3. 使用玻璃移液器将注射后的胚胎浸入温热的琼脂糖中 3 秒，然后立即用同一根玻璃移液器将胚胎从琼脂糖中取出，并携带一滴琼脂糖将胚胎放置于 35 mm 玻璃底培养皿的中央。每个液滴中仅放置一个胚胎。
4. 使用纤维探针或加样枪头轻轻调整胚胎方向，使胚胎脑部的背侧尽可能贴近玻璃底部。在琼脂糖逐渐凝固的过程中，轻柔地调节胚胎位置，使其充分伸展而不卷曲。
5. 随后，将玻璃底培养皿翻转，检查胚胎的位置。确保在显微镜下能够清晰观察到整个背侧前脑以及正确固定的胚胎。
6. 之后，加入 2–3 mL 预热至 28.5 °C 并含有三卡因的胚胎培养基，以完全覆盖胚胎。将培养皿妥善放置于共聚焦显微镜的温控载物台上，如图 1所示。调节成像室温度至 28.5 °C。此时胚胎已准备就绪，可进行成像。

结果

图1：实验步骤流程图 表达 MyR-Tdtomato 报告基因的转基因斑马鱼于第1天与AB野生型斑马鱼杂交。第2天挑选红色荧光胚胎进行显微注射，随后进行延时成像。整个实验在第2天完成^nd 一天大约需要8小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek 公司	P35GC-1.5-10-C
气压注射仪	Narishige	IM300
抗小鼠 IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl₂·2H₂O	Sigma-Aldrich	C3306
毛细管，外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带丝状结构	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 转盘式/高速宽场共聚焦系统	Nikon	N/A	Nikon Ti 倒置荧光显微镜，配备 CSU-W1 大视野共聚焦系统。
Dumont 医用镊子 5 型	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 拉针仪	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	M2773
显微操作器	World Precision Instruments	WPI M3301R
小鼠抗 Dld 抗体	Abcam	AB_1268496
Zenon 小鼠 IgG 封闭缓冲液	Thermo Fisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
酚红	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPure™ 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520050