植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的免疫定位

摘要

来源：Costa, M., 等. 植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位. J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种免疫染色技术，用于定位植物组织中的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶。经过固定并包埋在树脂中的植物组织切片，使用针对AGP和果胶的特异性一抗、荧光标记的二抗以及一种纤维素结合型荧光染料进行染色，以揭示它们在细胞壁中的组织特异性共定位情况。

方案

1. 免疫定位

注意： 荧光免疫定位实验依赖于两种抗体的依次使用。一抗是针对特定目标抗原产生的抗体；二抗则是专门针对一抗产生的，并且在荧光技术中与荧光素（本实验方案中为 FITC [异硫氰酸荧光素]）偶联。一抗用于检测样本中的目标抗原，而二抗则用于标记在洗去未结合的一抗后，一抗与样本结合的位置。对照实验是本检测的重要组成部分，必须始终进行，以确保观察结果的准确性。应在载玻片上保留一个孔作为阴性对照，该孔中省略一抗处理步骤，因此在实验结束时不应观察到任何信号。实验中还必须包含一个阳性对照，即使用一种已知且确定能够产生标记的抗体处理其中一个孔。阳性对照用于验证二抗标记的有效性及反应条件是否合适，而阴性对照则用于检测二抗的特异性。

1. 准备一个孵育室：在移液器吸头盒底部放入一些湿润的纸巾，并用锡箔纸包裹（图1B-1E）。将载玻片放入孵育室中。
2. 每8 mm孔加入50 μL封闭液（含5%脱脂奶粉（w/v）的1 M磷酸盐缓冲液[PBS]），孵育10分钟。移除封闭液，并用PBS洗涤所有孔两次，每次10分钟。
3. 配制一抗溶液（见表1），按1:5（v/v）比例将抗体加入封闭液中；每8 mm孔约需40 μL。
   注意：抗体浓度需根据生产商说明书进行调整。
4. 用双蒸水（ddH₂O）进行最后一次洗涤，洗涤5分钟，切勿让孔完全干燥。
5. 向反应孔中加入一抗溶液。向对照孔中加入封闭液。
6. 盖上孵育室，室温孵育2小时，随后在4 °C过夜孵育。同时配制二抗溶液，按1%（v/v）比例加入封闭液中，每孔约40 μL。用锡箔纸覆盖避光保存。
7. 所有孔用PBS洗涤两次，每次10分钟，随后再用ddH₂O洗涤10分钟。确保孔内无残留封闭液或沉淀物。
8. 向所有孔中加入二抗溶液。此后所有操作均需避光处理载玻片。
9. 室温避光孵育3–4小时。
10. 所有孔用PBS洗涤两次，每次10分钟，随后再用ddH₂O洗涤10分钟。
11. 向每个孔中加入一滴Calcofluor（PBS中含1:10,000（w/v）荧光增白剂28）。无需洗涤，直接向每个孔中加入一滴封片剂（见材料表），并加盖盖玻片（图2H）。
12. 使用配备10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95和100x/1.40物镜的荧光显微镜观察，分别采用UV滤光片（用于Calcofluor染色）和FITC滤光片检测细胞壁和免疫定位（图2I）。激发/发射波长（nm）分别为：UV 358/461，FITC 485/530。
13. 为更清晰地观察结果，可使用ImageJ或类似软件将两幅图像叠加。

表1：常用单克隆抗体列表。 上述表格列出了现有抗体的一个示例，包含其靶标信息以及购买来源。

名称	亲和性	供应单位
LM2	阿拉伯半乳聚糖蛋白	Plant probes (Leeds, U.K)
LM5	果胶
LM6	阿拉伯聚糖
LM7	同型半乳糖醛酸聚糖
LM8	木糖半乳糖醛酸聚糖
LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
LM14	阿拉伯半乳聚糖蛋白
LM16	加工后的阿拉伯聚糖 - RG-I
LM18	同型半乳糖醛酸聚糖
LM19	同型半乳糖醛酸聚糖
LM20	同型半乳糖醛酸聚糖
LM26	BRANCHED-GALACTAN
LM30	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM5	低甲酯化同型半乳糖醛酸聚糖	CCRC (Georgia, USA)
JIM7	高甲酯化同型半乳糖醛酸聚糖
JIM4	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM8	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM13	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM15	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM16	阿拉伯半乳聚糖蛋白
JIM20	伸展蛋白
MAC207	阿拉伯半乳聚糖蛋白

结果

图 1. (A) 制备样本（黄色块）用于超薄切片机切片的包埋块修块步骤示意图。 首先，移除明胶胶囊（1）。然后以 40° 至 45° 角度沿胶囊侧壁与样本相切的方向进行第一次修块（2）；第二次切割与第一次成 90°（3），随后按照相同规则进行第三次（4）和第四次切割（5）。经过第一阶段修块后，形成一个顶点位于样本上方的锥体结构。最后，使用锋利刀片垂直于树脂块主轴方向削去顶点，以暴露包埋的样本。在操作结束时应获得一个方形或梯形的表面（6）。(B) 制备孵育 chamber 所需材料：锡箔（1）、双面胶带（2）、纸巾（3）和移液器吸头盒（4）。(C) 第一步，用双面胶带将锡箔固定在盒子上。(D) 第二步，移除移液器吸头架，在盒子底部放置纸巾。(E) 第三...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔玻璃反应板	Marinfeld	MARI1216750	其他品牌也可使用
山羊抗大鼠IgG（全分子）-FITC抗体	Sigma-Aldrich	F6258
盖玻片，24 mm × 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	盖玻片应覆盖所有孔。也可使用其他品牌
ddH₂O2O	无	无
无水乙醇	无	na
荧光增白剂 28	Sigma-Aldrich	F-6259
脱脂奶粉	雀巢	无	任何脱脂奶粉均可使用
烘箱	na	无	通用实验室烘箱
大鼠源单克隆抗体	植物探针	na	可识别细胞壁组分的多种抗体可在复杂碳水化合物研究中心（CCRC，美国佐治亚大学）和植物探针公司（Plant Probes，英国利兹大学Paul Knox细胞壁实验室）获得。补充表1列出了部分常用单克隆抗体及其购买来源。
配备紫外光和FITC荧光滤光片的直立式落射荧光显微镜	Leica Microsystems	DMLb
真空室	无	na
真空泵	无	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	可使用其他抗荧光淬灭剂。请务必检测其与FITC及荧光增白剂28的兼容性。（注：对于非商业替代方案，参见Jonhson等，198218。可通过将25 mg/mL的1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于体积比为9:1的甘油与1×PBS混合液中制备抗荧光淬灭封片介质。用稀释的HCl调节pH至8.6。）