使用夹心 ELISA 法测定疫苗中免疫原性糖蛋白的含量

摘要

来源：Jallet, C. 等，体外 ELISA 法评估狂犬病疫苗效价 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种间接酶联免疫吸附测定法，即ELISA夹心免疫捕获法，用于评估疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。将含有糖蛋白特异性抗体的检测板与系列稀释的疫苗样本（包括参考疫苗和待测疫苗）共同孵育，随后通过免疫测定法定量待测疫苗中的糖蛋白含量。

方案

1. 安全防护措施

注意： 该方法适用于活体狂犬病病毒（RABV）和灭活疫苗。

1. 遵循良好的实验室规范和安全操作规程。
2. 穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括一次性实验服、手套、口罩、护目镜等。
3. 当滴定活病毒时，应在II级生物安全柜中操作。
   1. 所有与样本接触过的材料（试剂、洗涤液等）均应视为具有传染性的物质。
   2. 将受污染的材料浸入含2.5%次氯酸钠的漂白剂溶液中30分钟，以进行去污处理。
4. 根据良好的实验室规范操作化学品。

2. 准备

1. 尽可能使用分析纯试剂。
2. 配制包被缓冲液/碳酸盐缓冲液、封闭缓冲液、稀释液和柠檬酸盐缓冲液的新鲜溶液（表1），经0.45或0.22 µm滤器过滤，并在4 °C保存一天，使用前以保持其分析纯度。
3. 使用前30分钟将试剂置于室温（+18 °C至+25 °C），使用前通过轻柔混匀使其均匀化。

3. 微孔板致敏

注意：使用经过优化、可高效结合大量免疫球蛋白的 96 孔吸附免疫测定板（例如，参见 材料表）。

1. 向每个孔中加入 200 µL 用碳酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体（mAb-D1）。
   注意： 经实验确定，最佳浓度约为 1 µg/mL，相当于纯化后的 mAb-D1 约 1/2000 的稀释度。每批 mAb-D1 所推荐的浓度应参照说明，并需定期使用阳性对照进行验证。
2. 用粘性封板膜覆盖板孔，将微孔板置于湿润环境中，37 °C 孵育 3 小时。
3. 小心抽吸并将孔内液体转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
4. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上静置干燥 5 分钟。

4. 微孔板钝化

1. 向每个孔中加入 300 µL 封闭缓冲液。
2. 用封口膜覆盖板孔，于 37 °C 孵育 30 分钟。
3. 小心吸出液体，并将孔内内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的接收容器中。
4. 将微孔板倒置，室温下置于吸水纸上干燥 1 分钟。
   注意： 微孔板可立即使用，或密封后于 -20 °C 保存，最长可保存 3 个月，直至使用。

5. ELISA 检测

注意： 建立参考疫苗的对照曲线时，无需执行步骤 5.3；而测定待测疫苗时，必须完成所有步骤 5.1 至 5.6。

1. 致敏微孔板的洗涤
   1. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
   2. 小心抽吸，并将孔内液体转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
   3. 重复步骤 5.1.1 和 5.1.2 五次，以充分洗涤致敏板。
   4. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
2. 对照曲线用参考疫苗的稀释
   1. 用 1 mL 蒸馏水重悬参考疫苗（验证抗原批号 09），使其狂犬病病毒糖蛋白浓度为 10 µg/mL。
   2. 用稀释液将重悬后的参考疫苗进行 10 倍稀释，使狂犬病病毒糖蛋白浓度达到 1 µg/mL。
   3. 按照 表 1所示，用稀释液对该参考疫苗进行 6 次连续的 2 倍稀释。
   4. 在稀释液中每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 1H/2H），作为空白对照。
   5. 将每种参考疫苗稀释液每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 G1/G2 至 A1/A2）。
3. 待测疫苗的稀释及其滴定
   1. 用稀释液将待测疫苗进行 10 倍稀释。
   2. 按照 表 2所示，用稀释液对待测疫苗进行 7 次连续的 2 倍稀释。
   3. 将每种待测疫苗稀释液每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 H3/H4 至 A3/A4）。
4. ELISA 板的孵育/洗涤
   1. 用粘性封板膜覆盖微孔板，于 37 °C 孵育 1 小时。
   2. 移除封板膜，小心抽吸，并将每孔内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
   3. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
   4. 小心抽吸，并将每孔内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
   5. 重复步骤 5.4.3 和 5.4.4 五次，以去除未结合的抗原，保留与包被抗体（mAb D1）结合的 G 蛋白三聚体。
   6. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
5. 辣根过氧化物酶标记的 mAb-D1 的结合
   1. 将推荐稀释度（1/2000）的辣根过氧化物酶标记 mAb-D1 稀释液每孔加入 200 µL（稀释后浓度约为 1 µg/mL）。每批 mAb-D1 均有推荐使用浓度，需定期通过阳性对照验证。
   2. 用粘性封板膜覆盖微孔板，于 37 °C 孵育 1 小时。
   3. 移除封板膜，小心抽吸，并将每孔内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
   4. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
   5. 小心抽吸，并将每孔内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
   6. 重复步骤 5.5.4 和 5.5.5 五次，以去除未结合的辣根过氧化物酶标记抗体（mAb D1）。
   7. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
6. 使用底物-显色剂进行显色
   1. 向每孔加入 200 µL 底物-显色剂溶液。
   2. 用封板膜密封微孔板，避光、室温孵育 30 分钟。出现黄色至橙色，其颜色深浅与结合的辣根过氧化物酶标记抗体（mAb D1）量成正比。
   3. 每孔加入 50 µL 终止液，终止反应。
   4. 小心擦拭微孔板底部，放入分光光度计中测定所有使用孔的吸光度（OD），波长为 492 nm，包括阴性对照（空白）、参考疫苗和待测疫苗。
   5. 以 .xls 或 .xlsx 文件格式收集 OD 数据用于分析。

表1. 实验中使用的缓冲液。

缓冲液与试剂	准备
包被缓冲液 （50 mM 碳酸盐缓冲液，pH = 9.6）	加入 50 mM 碳酸钠（Na2CO3-10H2O) 至 50 mM 碳酸氢钠 (NaHCO₃)3)直至达到所需 pH 值（约加入十分之一体积的碳酸氢钠）
钝化缓冲液	0.3% 牛血清白蛋白（BSA，V 型组分），5% 蔗糖溶于 50 mM pH 9.6 碳酸盐缓冲液
10x 磷酸盐缓冲液，pH=7（PBS 10x）	NaCl 80 g，KCl 2 g，Na2PO4-12小时2O 11.33 g，KH2PO4 2 g 溶于 1 L 蒸馏水中，用 4 N NaOH 调节 pH 至 7
洗涤缓冲液	1× PBS 中含 0.05% 吐温
稀释液	0.5% 牛血清白蛋白（V 型组分），0.05% 吐温溶于 1× PBS（因 BSA 造成酸化，需将 pH 调至 7）
pH 5.6 的柠檬酸盐缓冲液 （用于过氧化物酶底物）	11.67 g 三水合柠檬酸三钠2O (Na3C6H5O7-2H20），2.17 g 柠檬酸-1H2O  在1升蒸馏水中
底物-显色剂溶液	50 mg 邻苯二胺片剂，0.1% 过氧化氢 30%（110 体积）  在25 ml pH 5.6的柠檬酸盐缓冲液中
终止液 （4N 硫酸）	将10 ml 36N H2SO4 缓缓加入80 ml 冷却的蒸馏水中，稀释过程必须在冰浴中进行

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
II级生物安全柜	赛默飞世尔科技	10445753	若对活病毒进行滴定
透明平底免疫非无菌96孔板，400 µL，MAXISORP	赛默飞世尔科技	439454	适用于与加载的抗体结合
Equip Labo 聚丙烯实验室通风橱	赛默飞世尔科技	12576606	用于硫酸的配制
免疫学板强 吸附型 MAXISORP 平底板 96 孔板 F96	Dutscher	55303	适用于与负载的抗体结合
微孔板封板膜（100片）	赛默飞世尔科技	15036
微孔板  单通道读板仪 Sunrise	TECAN
微孔板振荡培养箱	Dutscher	441504
微孔板洗板机 Wellwash	ThermoFisher Scientific	5165000
多通道移液器（30-300 µL），12通道	赛默飞世尔科技	4661180N
单通道移液器（试剂盒2：Finnpipettes F2 0.2-2 μL 微量，2-20 μL，20-200 μL） & 100-1000 μL	赛默飞世尔科技	4700880