基于微流控探针筒的过敏原特异性免疫球蛋白 E 检测系统

摘要

来源:Huang， Z. et al. 生物芯片微流控技术检测血清过敏原特异性免疫球蛋白 E （sIgE） 的应用。J. Vis. Exp.（2019 年）

该视频演示了使用基于微流体卡盒的化学发光系统检测血清特异性免疫球蛋白 E 的方案。血清 IgE 与固定在小柱反应区的不同过敏原相互作用，随后用过氧化物酶偶联的抗 IgE 抗体和化学发光底物进行检测，从而可以同时检测多种过敏原特异性 IgE。

方案

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 学习组基本信息

>注:呼吸疾病国家重点实验室 （AIR-SKLRD） 的过敏信息库是广州呼吸病研究所 （GIRH） 内建立的大型血清库。AIR-SKLRD 始于过去十年，已经开始收集和储存过敏性疾病患者的血清样本及其临床信息（表 1）。目前的研究是使用来自 AIR-SKLRD 的血清进行的。

1. 搜索 AIR-SKLRD 的数据库，查找 2015 年 1 月至 2018 年 6 月收集的血清，并选择被发现对该地区常见过敏原敏感的过敏性疾病患者。
2. 确保所有选定的患者都患有过敏相关疾病，例如过敏性鼻炎和/或哮喘、过敏性皮炎和/或荨麻疹，并且这些患者的血清中含有该系统 1 检测到的该区域常见过敏原的多种血清过敏原特异性免疫球蛋白 E （sIgE） 致敏作用。
3. 排除病历不完整的患者、失访的患者、拒绝就将血清样本用于科学目的给予知情同意的患者、已确定免疫缺陷的患者、目前正在接受免疫治疗或免疫调节剂的患者，或被发现患有寄生虫感染的患者。
4. 确保在血清采集前没有给予治疗或药物处方，以尽量减少对实验室结果的干扰。所有不符合标准的血清样品均被剔除。

2. 研究流程和感兴趣的测量

注意:微流控系统需要 100 μL 血清来确定 19 种过敏原。使用含有分离凝胶的真空血管从每位患者身上收集静脉血 （5 mL）。以 1,000 x g 离心 10 分钟后，收集上层用于检测。将未使用的血清储存在 -80 °C 下。检测前，将血清在室温下保存 30 分钟，并用涡旋混合器摇动。避免了重复的冻融循环。

1. 主要检测血清样品中 Dermatophagoides pteronyssinus （d1）、Dermatophagoides farinae （d2）、Blomia tropicalis （d201）、猫皮屑 （e1）、狗皮屑 （e5）、百慕大草 （g2）、梯牧草 （g6）、蟑螂 （i6）、烟曲霉 （m3）、白色念珠菌（M5）、豚草 （W1）、蛋清 （F1）、牛奶 （F2）、小麦 （F4）、花生 （F13）、大豆 （F14）、杏仁 （F20）、蟹 （F23） 和虾 （F24）。按照第 3.
   节中给出的说明进行作 注:sIgE 测定使用过敏原特异性 IgE 检测试剂盒（参见材料表）进行，并通过化学发光分析仪测量。
2. 从血清含量足够（至少 900 μL）的样品中随机选择 3 个样品进行重现性研究。保持所有条件不变，连续 9 天每天测量三种血清的过敏原 sIgE（即 100 x 9 = 900 μL 血清）。

3. 微流控系统的半自动化测试程序

注:系统 2 集成了自动微流控技术、蛋白质微阵列、冷光分析、并行 IgE 分析和图像处理技术。测试方案分为四个部分:设备准备、样品加载、孵育和测量。

1. 设备准备
   1. 打开 PC 和分析仪电源。
      注意:电源开关位于底座的左侧。
   2. 在 PC 上启动 LabIT 程序。如果弹出 Dark Frame 警告窗口，请单击 OK 运行 LEAK 测试。之后，点击中心标志进入作界面
      注意:如果空闲超过 24 小时，系统会提醒用户运行 LEAK Test。
   3. 检查屏幕右下角的反应温度和 CCD（电荷耦合器件）温度。反应温度应在约 10 分钟内升至 37 °C ± 1 °C，CCD 温度应在 1 °C ±降至 -15 °C。
   4. 在 CCD 温度降至 -15 °C ± 1 °C 后运行泄漏测试。在运行 LEAK 测试之前，请确保仪器内没有其他物品并关上门。单击"工具"|"系统测试"|"泄漏测试"。测试期间不要打开门。测试完成后，将弹出报告窗口。
2. 样品加载
   1. 将 620 μL 洗涤缓冲液、120 μL 封闭缓冲液、60 μL 偶联物 A 和 B、60 μL 底物 A 和 B 以及 100 μL 血清样品添加到微流体卡盒上的相应试剂槽中。
3. 孵化
   1. 单击 Cartridge ID，使用条形码扫描仪扫描小柱的序列号，输入样品 ID，将小柱放入分析仪，关上门，然后单击 Analyzer（分析器）和 Run（运行）开始分析。
4. 测量
   1. 测量后将结果导出到统计软件（例如 Excel）
      注:孵育 30 分钟后，分析仪自动执行测量并报告结果。

表 1:患者人口统计学特征。总共发现了 293 名符合纳入标准的受试者，中位年龄为 23 岁（四分位距从 8 岁到 36 岁）。其中，男性 170 例 （58.02%），女性 123 例 （41.98%）。此外，其中 92 例 （31.40%） 患有过敏性鼻炎，117 例 （39.93%） 患有过敏性哮喘，36 例 （12.29%） 患有鼻炎和哮喘的合并症，48 例 （16.38%） 患有其他过敏性疾病，如食物过敏或皮肤过敏。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 特征 编号（%） 性别，n（%） 女性 123人（41.98%） 雄 170（58.02%） 年龄、年份、n（%） 中位数 （25%，75%） 23（8,36） ≤10 97人（33.11%） 11-20 37人（12.63%） 21-40 岁 101 人（34.47%） >41 58人（19.80%） 诊断，n（%） 枯草热 92人（31.40%） 过敏性哮喘 117人（39.93%） 过敏性鼻炎伴哮喘 36人（12.29%） 别人 48人（16.38%）

材料