一种基于微流控芯片的过敏原特异性免疫球蛋白E检测系统

摘要

来源：Huang, Z.，等。生物芯片微流控技术在血清特异性免疫球蛋白E（sIgE）检测中的应用 J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了一种利用基于微流控芯片的化学发光系统检测血清特异性免疫球蛋白E的方法。血清IgE与固定在芯片反应区内的不同变应原发生相互作用，随后通过辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体和化学发光底物进行检测，从而实现多种变应原特异性IgE的同步检测。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 研究组的基本信息

注意： 呼吸疾病国家重点实验室过敏信息库（AIR-SKLRD）是建于广州呼吸健康研究院（GIRH）内部的一个大型血清库。该库在过去十年中启动，已开始收集并储存过敏性疾病患者的血清样本及其临床信息（表1）。本研究使用的血清样本来自AIR-SKLRD。

1. 在 AIR-SKLRD 数据库中检索 2015 年 1 月至 2018 年 6 月期间采集的血清样本，筛选出对该地区常见过敏原敏感的过敏性疾病患者。
2. 确保所选患者均患有过敏相关疾病，如过敏性鼻炎和/或哮喘、过敏性皮炎和/或荨麻疹，并且这些患者的血清经系统 1 检测出对本地区常见过敏原存在多种血清特异性免疫球蛋白 E（sIgE）致敏反应。
3. 排除病历资料不完整、失访、拒绝签署知情同意书（同意其血清样本用于科研用途）、已确诊免疫缺陷、正在接受免疫治疗或使用免疫调节药物，或检出寄生虫感染的患者。
4. 确保在采集血清前未给予任何治疗或药物处方，以尽量减少对实验室检测结果的干扰。所有不符合上述标准的血清样本均被剔除。

2. 研究流程与关注的测量指标

注意： 微流控系统需要 100 µL 血清来检测 19 种过敏原。使用含分离胶的真空采血管从每位患者采集静脉血（5 mL）。在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟后，收集上层液体用于检测。未使用的血清储存在 -80 °C。检测前，血清在室温下放置 30 分钟，并用涡旋混合器振荡。避免反复冻融。

1. 主要检测血清样本中针对以下完整变应原的特异性IgE（sIgE）： Dermatophagoides pteronyssinus (d1)、 Dermatophagoides farinae (d2)、 Blomia tropicalis (d201)、猫皮屑(e1)、狗皮屑(e5)、百慕大草(g2)、梯牧草(g6)、蟑螂(i6)、 Aspergillus fumigatus (m3)、 Candida albicans (m5)、豚草(w1)、蛋清(f1)、牛奶(f2)、小麦(f4)、花生(f13)、大豆(f14)、杏仁(f20)、蟹(f23)和虾(f24)。操作步骤遵循第3节中的说明。
   注意： sIgE的测定采用变应原特异性IgE检测试剂盒（见 材料表），并通过化学发光分析仪进行检测。
2. 从血清量充足（至少900 µL）的样本中随机选取三个样本进行重复性研究。在所有条件保持不变的情况下，连续9天每天测定这三份血清中的变应原sIgE（即每次100 µL，共9次，总计消耗900 µL血清）。

3. 微流控系统的半自动化测试流程

注意：系统2集成了自动微流控技术、蛋白质微阵列、冷光分析、并行IgE分析和图像处理技术。检测流程分为四个部分：仪器准备、加样、孵育和检测。

1. 设备准备
   1. 打开电脑和分析仪电源。
      注意： 电源开关位于底座左侧。
   2. 在电脑上启动 LabIT 程序。如果弹出 Dark Frame 警告窗口，请点击 OK 运行 LEAK Test。随后点击中央标志进入操作界面。
      注意： 若系统闲置超过 24 小时，将提示用户运行 LEAK Test 。
   3. 检查屏幕右下角的反应温度（Reaction Temp）和 CCD（电荷耦合器件）温度。反应温度应在约 10 分钟内升至 37 °C ± 1 °C，CCD 温度应降至 -15 °C ± 1 °C。
   4. 当 CCD 温度降至 -15 °C ± 1 °C 后，运行 LEAK Test 。在运行 LEAK 测试前，确保仪器内部无其他物品，并关闭门。点击 Tools | System Test | LEAK Test。测试过程中请勿打开门。测试完成后，报告窗口将自动弹出。
2. 加样
   1. 向微流控芯片的相应试剂槽中加入 620 µL 洗涤缓冲液、120 µL 封闭缓冲液、60 µL 共轭物 A 和 B、60 µL 底物 A 和 B，以及 100 µL 血清样本。
3. 孵育
   1. 点击 Cartridge ID，使用条形码扫描器扫描芯片的序列号，输入样本编号，将芯片放入分析仪中，关闭门，然后点击 Analyzer 和 Run 以开始分析。
4. 检测
   1. 检测完成后，将结果导出至统计软件（例如 Excel）。
      注意： 孵育 30 分钟后，分析仪将自动进行检测并报告结果。

表1：患者人口统计学特征。 总共纳入符合标准的受试者293名，中位 年龄为23岁（四分位距为8至36岁）。其中男性170名（58.02%），女性123名（41.98%）。此外，92名（31.40%）患有过敏性鼻炎，117名（39.93%）患有过敏性哮喘，36名（12.29%）同时患有鼻炎和哮喘，48名（16.38%）患有其他过敏性疾病，如食物过敏或皮肤过敏。

特征	例数(%)
性别，例数(%)
女性	123(41.98%)
男性	170(58.02%)
年龄，岁，例数(%)
中位数 (25%,75%)	23(8,36)
≤10	97(33.11%)
11-20	37(12.63%)
21-40	101(34.47%)
>41	58(19.80%)
诊断，例数(%)
过敏性鼻炎	92(31.40%)
过敏性哮喘	117(39.93%)
过敏性鼻炎合并哮喘	36(12.29%)
其他	48(16.38%)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agnitio BioIC 分析仪	Agnitio Science & Technology(中国台湾)	BA-G2000
BioIC 过敏原特异性IgE检测试剂盒	Agnitio Science & Technology(中国台湾)	DR17A12
BioIC 芯片放置板	Agnitio Science & Technology(中国台湾)	T20SET
BioIC 试剂分配器	Agnitio Science & Technology(中国台湾)	DS-1
二维条码图像扫描仪	Agnitio Science & Technology(中国台湾)	NLS-HR200
VORTEX-5 涡旋混合器	海门市麒麟bell实验仪器有限公司	VORTEX-5