外泌体的免疫捕获与流式细胞术抗原表征

摘要

来源：Arakelyan, A. 等，利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用荧光标记的捕获抗体-磁性纳米颗粒偶联物进行细胞外囊泡的免疫捕获。该过程包括复合物的形成、使用荧光标记的检测抗体进行染色、磁分离以及流式细胞术分析，以实现抗原表征。

方案

1. 磁性纳米颗粒（MNPs）的偶联

1. 使用商用偶联方法和试剂将磁性纳米颗粒（MNPs）与抗体（Abs）（通常为1 mg）进行偶联。采用带有羧基作为反应基团的氧化铁纳米颗粒。
   1. 如果抗体体积超过0.5 ml，使用100K浓缩管进行浓缩。在2,000 × g 条件下离心3–5分钟。
2. 在偶联步骤结束后，加入10 µl封闭缓冲液，将MNPs转移至12 mm × 75 mm的离心管中，并加入3 ml洗涤/储存缓冲液。将离心管置于磁力分离器的中心孔中，在4 °C下静置过夜。
3. 确认MNPs已全部吸附至管壁一侧后，小心吸除全部上清液。加入3 ml新鲜的洗涤/储存缓冲液，再放回磁力分离器中。
4. 数小时后，检查MNPs是否已完全吸附至管壁一侧，随后吸除上清液。用2 ml洗涤/储存缓冲液重悬MNPs，并在4 °C下保存。
5. 通过使用相应的荧光标记Fab抗体片段（例如 若捕获抗体为小鼠单克隆抗体，则使用抗小鼠IgG的山羊Fab片段，如第2节所述）对MNPs进行标记，并在流式细胞仪上检测，以验证抗体是否成功偶联至MNPs。

2. 与磁性纳米颗粒偶联的抗体标记

1. 在1.5 ml微量离心管中，将60 µl（每种条件，3.9 x 10¹² 个颗粒）磁性纳米颗粒（MNPs）与5 µl（200 µg/ml商品化溶液）标记的Fab片段混合，Fab片段需针对捕获抗体（Ab）的同种型。
2. 室温（RT）持续混匀孵育30分钟。
3. 用300 µl磷酸盐缓冲液（PBS）预润湿100K浓缩柱，在微量离心机中以1,500 x g离心5分钟。
4. 在100K柱上纯化标记的复合物。将步骤2.2中的混合物在微量离心机中以1,500 x g离心5分钟，用200 µl PBS洗涤，并回收至初始体积。

3. 使用标记的抗体-磁性纳米颗粒复合物捕获目标颗粒（细胞外囊泡，EVs）

1. 将预先标记的MNPs 60 µl（3.9 × 10¹² 颗粒）与EV制备物（100 µl）共同孵育。
   1. 使用不同方法制备EV样品。此处，通过蔗糖梯度纯化EV，或使用外泌体沉淀试剂从乏血小板血浆中收集EV，或直接从血浆中分离EV。       
      注意：最佳比例需根据每次实验的具体情况确定，取决于EV制备物中的EV浓度。MNP-Ab部分应比EV部分的浓度高出约10⁶ 倍。
2. 在4 °C下孵育1小时，用于EV处理。
3. 加入2.5%小鼠IgG/人IgG以阻断Fc结合，轻轻涡旋混匀，在室温下孵育3–5分钟。
4. 加入生产商推荐或已滴定确定的各检测抗体浓度，在室温下继续孵育20分钟。

4. 使用磁性柱分离MNP捕获的EV与未结合的抗体

1. 将磁性分离柱置于分离磁铁中，以准备使用。
2. 用500 µl洗涤缓冲液（含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液）预润湿柱子，使洗涤缓冲液完全流过柱体。
3. 将MNP-EV复合物加入柱中，待所有液体流尽后，再加入500 µl洗涤缓冲液，使全部体积通过柱体。
4. 重复使用洗涤缓冲液洗涤柱体2次。
5. 将柱子从磁铁上取下，放入12 mm × 75 mm试管中以收集保留的MNP-EV复合物。让柱子在试管中脱离磁铁静置3分钟。加入200 µl PBS，使磁珠在重力作用下流出；再加入200 µl PBS，并在洗脱后用200 µl 4%多聚甲醛固定。
   注意：多聚甲醛疑似致癌物，应在通风橱中操作并佩戴手套。
6. 为定量单个EV，可在高通量进样器（HTS）上使用体积定量模式，或在采集前加入充分混匀的流式细胞术计数微球。

5. 使用流式细胞仪分析磁性纳米颗粒捕获的细胞外囊泡

1. 将流式细胞仪预热 30 分钟。
2. 运行质控微球。
3. 根据磁性纳米颗粒（MNPs）或标记的细胞外囊泡（EVs）的荧光设定阈值。使用 0.22 µm 滤膜过滤的 PBS 设定阈值，以降低背景“噪声”。通过调节光电倍增管（PMT）电压，使过滤后的 PBS 不产生或仅产生极少的信号事件，以此设定阈值。
4. 以低速运行样品。（在标准 0.2 µm 鞘液过滤器后串联一个额外的 0.04 µm 在线过滤器，以进一步消除假信号事件）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
羧基磁性氧化铁纳米颗粒偶联试剂盒	Ocean Nanotech	ICK-15-005
Amicon Ultra-4 离心滤过装置（Ultracel-100 膜）	Millipore	UFC810024
5 mL 圆底聚丙烯试管，无盖	Falcon	352002
DEPC处理水	优质生物材料	351-068-131
SuperMAG-01 磁力分离器	Ocean Nanotech	SuperMAG-01
Zenon R-藻红蛋白小鼠IgG1 标记试剂盒	赛默飞世尔科技	Z25055
采用Omega膜的Nanosep离心装置 100k	Pall Corp	OD100C34
EDTA 0.5 M	Corning Cellgro	46-034-CI
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A9576-50ML
PBS	Gibco	10010-23
甲醛聚合物，电镜级，纯化	EMS	15710
123count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CytoCount 微球	Dako	S2366
AccuCheck 计数微球	Invitrogen	PCB100
细胞仪设置 & 追踪珠试剂盒（CST）	BD生物科学	642412
仪器设备
µMACS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-701
OctoMACS 分离器磁铁	Miltenyi Biotec	130-042-108
Nanodrop	赛默飞世尔科技	无
NanoSight NS300	Malvern	无
BD LSRII 流式细胞仪	BD 生物科学	无
软件
Flowjo 软件	Flowjo
BD FACSDiva 软件	BD