外泌体的免疫捕获与流式细胞术抗原表征

摘要

来源：Arakelyan, A. 等，利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用荧光标记的捕获抗体-磁性纳米颗粒偶联物进行细胞外囊泡的免疫捕获。该过程包括复合物的形成、使用荧光标记的检测抗体进行染色、磁分离以及流式细胞术分析，以实现抗原表征。

方案

1. 磁性纳米颗粒（MNPs）的偶联

1. 使用商用偶联方法和试剂将磁性纳米颗粒（MNPs）与抗体（Abs）（通常为1 mg）进行偶联。采用带有羧基作为反应基团的氧化铁纳米颗粒。
   1. 如果抗体体积超过0.5 ml，使用100K浓缩管进行浓缩。在2,000 × g 条件下离心3–5分钟。
2. 在偶联步骤结束后，加入10 µl封闭缓冲液，将MNPs转移至12 mm × 75 mm的离心管中，并加入3 ml洗涤/储存缓冲液。将离心管置于磁力分离器的中心孔中，在4 °C下静置过夜。
3. 确认MNPs已全部吸附至管壁一侧后，小心吸除全部上清液。加入3 ml新鲜的洗涤/储存缓冲液，再放回磁力分离器中。
4. 数小时后，检查MNPs是否已完全吸附至管壁一侧，随后吸除上清液。用2 ml洗涤/储存缓冲液重悬MNPs，并在4 °C下保存。
5. 通过使用相应的荧光标记Fab抗体片段（例如 若捕获抗体为小鼠单克隆抗体，则使用抗小鼠IgG的山羊Fab片段，如第2节所述）对MNPs进行标记，并在流式细胞仪上检测，以验证抗体是否成功偶联至MNPs。

2. 与磁性纳米颗粒偶联的抗体标记

1. 在1.5 m....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
羧基磁性氧化铁纳米颗粒偶联试剂盒	Ocean Nanotech	ICK-15-005
Amicon Ultra-4 离心滤过装置（Ultracel-100 膜）	Millipore	UFC810024
5 mL 圆底聚丙烯试管，无盖	Falcon	352002
DEPC处理水	优质生物材料	351-068-131
SuperMAG-01 磁力分离器	Ocean Nanotech	SuperMAG-01
Zenon R-藻红蛋白小鼠IgG1 标记试剂盒	赛默飞世尔科技	Z25055
采用Omega膜的Nanosep离心装置 100k	Pall Corp	OD100C34
EDTA 0.5 M	Corning Cellgro	46-034-CI
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A9576-50ML
PBS	Gibco	10010-23
甲醛聚合物，电镜级，纯化	EMS	15710
123count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CytoCount 微球	Dako	S2366
AccuCheck 计数微球	Invitrogen	PCB100
细胞仪设置 & 追踪珠试剂盒（CST）	BD生物科学	642412
仪器设备
µMACS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-701
OctoMACS 分离器磁铁	Miltenyi Biotec	130-042-108
Nanodrop	赛默飞世尔科技	无
NanoSight NS300	Malvern	无
BD LSRII 流式细胞仪	BD 生物科学	无
软件
Flowjo 软件	Flowjo
BD FACSDiva 软件	BD