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1. 生物样品制备
注意:所选的解剖部位和采血量由每个研究者自行决定，不会影响检测结果。但是，一旦获得它们，应按照下面列出的步骤处理样品。
- 血清样品的制备
- 将所需体积的血液收集到首选的收集管中，并让其凝结至少 30 分钟。
- 在室温下以 1,000 x g 离心样品 10 分钟。
- 去除血清并立即进行检测，或分装到聚丙烯微量离心管中，并将样品储存在 ≤ -20 °C 下。
- 血浆样品的制备
- 使用乙二胺四乙酸 （EDTA） 涂层采血管采集所需体积的血液。
- 收集后 30 分钟内，在室温下以 1,000 x g 离心 10 分钟。
- 立即取出血浆并进行检测，或分装到聚丙烯微量离心管中，并将样品储存在 ≤ -20 °C 下。
- 组织培养上清液样品的制备
- 将样品在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 10 分钟以去除细胞和碎片。
- 收集上清液并立即测定或分装到聚丙烯微量离心管中，并在 ≤ -20 °C 下储存。
- 冷冻生物样品的解冻
将- 任何先前冷冻的生物样品在冰上完全解冻，并在使用前短暂涡旋。避免超过 2 次冻融循环。
注意:本方案中使用的样品是通过在各种条件下培养 BALB/c 小鼠脾细胞（1 x 106 个细胞，37 °C + 5% CO2 获得:未刺激、LPS （100 ng/mL）、αCD3（1 μg/mL 板包被）+ αCD28（1 μg/mL 可溶性）、PMA （20 ng/mL） + 离子霉素 （500 ng/mL）。48 小时后收集培养物上清液，并按照第 1.3 节所述处理。
2. 试剂制备
- 预混抗体固定磁珠的制备
- 在室温下在超声仪浴中对预混合的珠瓶进行超声处理 1 分钟，然后在使用前涡旋 30 秒。如果没有可用的超声浴，请将涡旋时间增加到 1 分钟。
- 洗涤缓冲液的制备
- 将试剂盒随附的 20 倍洗涤缓冲液（20 倍 PBS 含 1% Tween-20）置于室温并涡旋以将所有盐加入溶液中。
- 用 475 mL 去离子水稀释 25 mL 20x 洗涤缓冲液。将未使用的部分存放在 2 °C 至 8 °C 之间长达一个月。
- 基质 B 的制备（仅用于血清和血浆样品）
- 将试剂盒中包含的 5.0 mL 检测缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）添加到含有冻干基质 B 的瓶子中。至少需要 15 分钟以完全重构，然后涡旋混合均匀。剩余的重组基质 B 可在 ≤ -70 °C 下储存长达一个月。
3. 标准准备
注意:该组中的每种分析物的最高标准浓度为 10,000 pg/mL。
- 加入 250 μL 检测缓冲液，以重构冻干的小鼠 Th 细胞因子标准混合物。通过短暂涡旋混合，让样品瓶在室温下静置 10 分钟。
- 将标准混合物转移到标有"C7"的聚丙烯微量离心管中。这将被用作最高标准。
- 将 6 个聚丙烯微量离心管标记为 C6、C5、C4、C3、C2 和 C1。
- 向每个试管中加入 75 μL 检测缓冲液。
- 将 25 μL 顶级标准 C7 转移到 C6 管中，并通过涡旋充分混合。这将是 C6 标准。
- 继续进行连续 1:4 稀释，为每管使用新的移液吸头，将 25 μL 前一个标准品添加到下一个最低标准管中的 75 μL 分析缓冲液中，然后涡旋以获得标准品 C5、C4、C3、C2 和 C1。使用检测缓冲液作为 0 pg/mL 标准品 （C0）。
4. 样品稀释
注意:可能需要使用该测定法和多次稀释度进行初步中试实验，以确定特定生物样品组最合适的稀释因子。适当的稀释因子将为位于标准曲线范围内的样品生成浓度计算。以下步骤仅供参考，可能需要根据样品类型根据经验确定。
- 在聚丙烯微量离心><管中用检测缓冲液稀释血清或血浆样品 2 倍（例如，用 50 μL 检测缓冲液稀释 50 μL 样品）。
注意:如果需要进一步稀释样品，应使用基质 B 而不是分析缓冲液进行稀释，以确保准确测量。添加未经稀释的血清或血浆样品会导致检测准确度低，并可能堵塞滤板。基质 B 由耗尽内源性检测靶标的混合小鼠血清组成。它用作血清或血浆样品稀释剂，以避免基质效应，已知基质效应会影响免疫测定的分析灵敏度。
- 测试细胞培养上清液样品，无需稀释。
注意:不同样品的分析物水平差异很大。如有必要，使用相应细胞培养基或检测缓冲液的新鲜制备物稀释上清液样品。
5. 检测程序
注意:该检测可以在聚丙烯滤板、微荧光激活细胞分选 （FACS） 管或 V 型底微孔板中进行。推荐使用滤板分析程序，因为其样品间一致性好、分析稳定性好且易于作。此过程需要一个用于清洗的真空过滤装置（由最终用户提供）。
- 使用前让所有试剂升温至室温 （20 - 25 °C）。
- 在分析设置和孵育步骤中，始终将滤板放在倒置的板盖上，使板底部不接触任何表面，因为这可能会导致泄漏。
- 在整个检测过程中（包括洗涤步骤），请保持板直立，以避免磁珠丢失。
- 将板放在黑暗中或用铝箔包裹以进行所有孵育步骤。
- 将所有标准品和样品作为重复品按顺序排列在板上运行。
- 向每个孔中加入 100 μL 1x 洗涤缓冲液，预润湿滤板，并在室温下静置 1 分钟（如果使用过滤器底部微孔板）。
- 使用真空歧管 （5 - 10 s） 去除缓冲液体积。真空度不要超过 10 英寸 Hg。将板压在一叠干净的纸巾上，从板底部吸干多余的洗涤缓冲液。将板放在倒置的板盖上。
注意:如果使用 V 形底微孔板或微型 FACS 管进行检测，则可以省略步骤 5.1 - 5.2。
- 对于细胞培养上清液样品，向所有孔中加入 25 μL 检测缓冲液。向标准孔中加入 25 μL 每种标准品。向样品孔中加入 25 μL 每个样品。
- 要测量血清或血浆样品，向标准孔中加入 25 μL 基质 B。向样品孔中加入 25 μL 检测缓冲液。向标准孔中加入 25 μL 每种标准品。向样品孔中加入 25 μL 每种稀释的血清或血浆样品。
- 涡旋混合珠子 30 秒。向每个孔中加入 25 μL 混合珠子，间歇性摇动珠子瓶以避免珠子沉淀。添加珠子后，每个孔中的最终体积应为 75 μL。
- 用板密封剂密封板。用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。将板放在板振荡器上，固定，并在室温下以大约 500 rpm 的速度摇动 2 小时。为防止泄漏，请勿对封板机施加正压。
- 在不倒置的情况下，将板放在真空歧管上，像以前一样施加真空，并向每个孔中加入 200 μL 的 1x 洗涤缓冲液。
- 通过真空过滤去除检测板孔的内容物。用吸水垫或纸巾从板底部吸干多余的洗涤缓冲液。再重复一次此步骤。
注意:如果使用 V 形底微孔板或微型 FACS 管进行检测，请跳过步骤 1.12 和 1.13。相反，在室温下以 1,000 x g 离心板 5 分钟，然后使用多通道移液器去除上清液。
- 向每个孔中加入 25 μL 检测抗体（参见材料表）。
- 用新的板密封剂密封板。用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。
- 将板放在板振荡器上，并在室温下以大约 500 rpm 的速度摇动 1 小时。
- 无需抽真空，直接向每个孔中加入 25 μL 链霉亲和素-藻红蛋白 （SA-PE） 试剂。无需稀释试剂。
- 用新的板密封剂密封板。用铝箔包裹整个板，包括倒置的板盖。
- 将板放在板振荡器上，在室温下以大约 500 rpm 摇动 30 分钟。
- 重复上述步骤 1.13。
- 向每个孔中加入 200 μL 1x 洗涤缓冲液。将珠子重新悬浮在摇板机上 1 分钟。
- 使用多通道移液器将样品从滤板转移到 FACS 管中，以在流式细胞仪上读取样品。
注意:通过向每管中额外添加 100 μL 1x 洗涤缓冲液，以避免样品干涸，可将样品体积从 200 μL 增加到 300 μL。如有必要，样品可以储存在 4 °C 下，避光，并在第二天进行分析。然而，长时间的样品储存会导致信号减弱。