一种基于微球的多重免疫检测法用于定量多种细胞因子靶标

摘要

来源：Lehmann, J. S.，等。利用基于细胞计数微球的免疫检测平台对刺激后的小鼠脾细胞进行多重细胞因子分析。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种基于微球的多重免疫检测试验，用于定量样本中多种细胞因子靶标。该方法使用一组与细胞因子特异性抗体偶联的不同微球，以结合样本中存在的细胞因子。通过生物素标记的检测抗体，将链霉亲和素标记的报告分子固定在已结合的细胞因子上。流式细胞术根据微球的独特大小和内部荧光强度来识别已结合的细胞因子，而报告分子的荧光强度则反映细胞因子的数量。

方案

1. 生物样本制备

注意： 选择的解剖部位和采血量由各研究者自行决定，不会影响检测结果。然而，一旦获得样本，应按照以下列出的步骤进行处理。

1. 血清样本的制备
   1. 将所需体积的血液收集至合适的采血管中，并静置至少30分钟使其充分凝固。
   2. 在室温下以1,000 × g离心10分钟。
   3. 小心吸取血清，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，于≤ -20 °C保存。
2. 血浆样本的制备
   1. 使用经乙二胺四乙酸（EDTA）涂层处理的采血管收集所需体积的血液。
   2. 在采集后30分钟内，于室温下以1,000 × g离心10分钟。
   3. 小心吸取血浆，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，于≤ -20 °C保存。
3. 组织培养上清样本的制备
   1. 在4 °C下以1,500 × g离心10分钟，以去除细胞和碎片。
   2. 收集上清液，立即进行检测，或分装至聚丙烯微量离心管中，于≤ -20 °C保存。
4. 冻存生物样本的解冻
   1. 将先前冻存的生物样本置于冰上完全解冻，并在使用前短暂涡旋混匀。避免反复冻融超过2次。
      注意：本实验方案中所用样本系通过培养BALB/c小鼠脾细胞（1 × 10⁶ 个细胞，在37 °C + 5% CO₂ 条件下，分别在未刺激、LPS（100 ng/mL）、αCD3（1 µg/mL包被）+ αCD28（1 µg/mL可溶性）、PMA（20 ng/mL）+ 离子霉素（500 ng/mL）等不同条件下）获得。培养48小时后收集上清液，并按第1.3节所述方法处理。

2. 试剂配制

1. 预混抗体固定化微珠的制备
   1. 在室温下，将预混微珠瓶放入超声波水浴中处理1分钟，使用前再涡旋振荡30秒。若无超声波水浴设备，可将涡旋振荡时间延长至1分钟。
2. 洗涤缓冲液的制备
   1. 将试剂盒中提供的20x 洗涤缓冲液（含1% Tween-20的20x PBS）恢复至室温，并涡旋振荡使所有盐类充分溶解。
   2. 取25 mL的20x 洗涤缓冲液，加入475 mL去离子水中稀释。未使用部分可于2 °C至8 °C保存，最长一个月。
3. 基质B的制备（仅用于血清和血浆样本）
   1. 向含有冻干基质B的小瓶中加入5.0 mL试剂盒中的检测缓冲液（含1% BSA的PBS）。静置至少15分钟以确保完全重悬，随后涡旋振荡充分混匀。剩余的重悬基质B可在≤ -70 °C条件下保存，最长一个月。

3. 标准品制备

注意：该检测面板中的每种分析物的最高标准浓度均为 10,000 pg/mL。

1. 加入 250 µL 分析缓冲液以重悬冻干的小鼠 Th 细胞因子标准品混合液。短暂涡旋混匀，并将管置于室温下静置 10 分钟。
2. 将标准品混合液转移至已标记为“C7”的聚丙烯微量离心管中。此管将用作最高浓度标准品。
3. 标记 6 个聚丙烯微量离心管，分别为 C6、C5、C4、C3、C2 和 C1。
4. 向上述每支试管中加入 75 µL 分析缓冲液。
5. 将 25 µL 最高浓度标准品 C7 转移至 C6 管中，并通过涡旋充分混匀。此即为 C6 标准品。
6. 使用新的移液枪头，依次将前一标准品 25 µL 加入下一较低浓度标准管中（含 75 µL 分析缓冲液），每次加样后涡旋混匀，进行连续的 1:4 系列稀释，从而获得 C5、C4、C3、C2 和 C1 标准品。以分析缓冲液作为空白对照（0 pg/mL 标准品，记为 C0）。

4. 样品稀释

注意：使用该检测方法时，可能需要通过包含多个稀释梯度的初步预实验，来确定特定生物样本最合适的稀释倍数。合适的稀释倍数应使样本的浓度计算结果落在标准曲线的范围内。以下步骤仅为指导性建议，具体操作需根据样本类型通过实验经验确定。

1. 使用聚丙烯微量离心管，用测定缓冲液将血清或血浆样本进行2倍稀释（例如：将50 µL样本与50 µL测定缓冲液混合）。
   注意：如果需要进一步稀释样本，应使用Matrix B而非测定缓冲液进行稀释，以确保测量结果准确。未经稀释直接加入血清或血浆样本将导致检测准确性降低，并可能堵塞滤板。Matrix B由去除内源性检测靶标的混合小鼠血清组成，用作血清或血浆样本的稀释液，以避免基质效应，因为基质效应已知会影响免疫测定的分析灵敏度。
2. 细胞培养上清样本无需稀释，直接检测。
   注意：不同样本中分析物的水平可能存在显著差异。如有必要，可使用新鲜配制的相应细胞培养基或测定缓冲液稀释上清样本。

5. 检测步骤

注意：该实验可在聚丙烯滤板、微流式细胞分选（FACS）管或V型底微孔板中进行。推荐使用滤板法，因其具有良好的样品间一致性、实验稳定性以及操作简便等优点。本方法需要配备真空过滤装置用于洗涤步骤（由最终用户自行提供）。

1. 使用前将所有试剂恢复至室温（20 - 25 °C）。
2. 在实验设置和孵育过程中，始终将滤板置于倒置的板盖上，以防止板底接触任何表面，避免造成泄漏。
3. 在整个实验过程中（包括洗涤步骤），保持板直立，以防止磁珠丢失。
4. 所有孵育步骤期间，将板置于避光环境或用铝箔包裹。
5. 所有标准品和样品均需设复孔，并按顺序排列在板上。
6. 预润洗滤板：每孔加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，室温静置 1 分钟（若使用底部带滤膜的微孔板）。
7. 使用真空 manifold 去除缓冲液体积（5 - 10 秒），真空压力不得超过 10 "Hg。用干净纸巾轻压板底部以吸除残留洗涤缓冲液。将板放回倒置的板盖上。
   注意：若使用 V 型底微孔板或微量 FACS 管，则可省略步骤 5.1 - 5.2。
8. 对于细胞培养上清样本，每孔加入 25 µL 检测缓冲液。在标准品孔中加入 25 µL 各浓度标准品。在样本孔中加入 25 µL 各样本。
9. 对于血清或血浆样本检测，在标准品孔中加入 25 µL Matrix B。在样本孔中加入 25 µL 检测缓冲液。在标准品孔中加入 25 µL 各浓度标准品。在样本孔中加入 25 µL 经稀释的血清或血浆样本。
10. 涡旋振荡混合磁珠 30 秒。每孔加入 25 µL 混合磁珠，加样过程中间歇摇动磁珠瓶以防止磁珠沉降。加入磁珠后，每孔终体积应为 75 µL。
11. 用板封膜密封板。将整个板（包括倒置的板盖）用铝箔包裹。将板置于板式摇床，固定后于室温下以约 500 rpm 振荡孵育 2 小时。为防止泄漏，切勿对板封膜施加正压。
12. 不翻转板，将其置于真空 manifold 上，施加与之前相同的真空压力，并向每孔加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。
13. 通过真空过滤去除板孔中的内容物。用吸水垫或纸巾轻压板底部以去除残留洗涤缓冲液。重复此步骤一次。
    注意：若使用 V 型底微孔板或微量 FACS 管，则跳过步骤 1.12 和 1.13，改为在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，然后使用多通道移液器去除上清液。
14. 向每孔加入 25 µL 检测抗体（参见材料表）。
15. 使用新的板封膜密封板。将整个板（包括倒置的板盖）用铝箔包裹。
16. 将板置于板式摇床，于室温下以约 500 rpm 振荡孵育 1 小时。
17. 无需抽真空，直接向每孔加入 25 µL 链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）试剂。该试剂无需稀释。
18. 使用新的板封膜密封板。将整个板（包括倒置的板盖）用铝箔包裹。
19. 将板置于板式摇床，于室温下以约 500 rpm 振荡孵育 30 分钟。
20. 重复上述步骤 1.13。
21. 向每孔加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液。在板式摇床上重悬磁珠 1 分钟。
22. 使用多通道移液器将样本从滤板转移至 FACS 管中，用于流式细胞仪检测。
    注意：可通过向每管额外加入 100 µL 1× 洗涤缓冲液，将样本体积从 200 µL 增加至 300 µL，以避免样本干涸。如有需要，样本可在 4 °C 避光保存，并于次日检测。但长时间储存可能导致信号减弱。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Allegra 6R 离心机配 MICROPLUS 载体适配器	Beckman Coulter	366816	用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）
LEGENDplex 小鼠辅助性 T 细胞细胞因子检测试剂盒	BioLegend	740005	多重免疫检测试剂盒（13 重）
抗小鼠 CD3ε 抗体	BioLegend	100314	克隆号 145-2C11，低内毒素，无叠氮化物形式
抗小鼠 CD28 抗体	BioLegend	102112	克隆号 37.51，低内毒素，无叠氮化物形式
真空泵	EMD Millipore	WP6111560	用于使用滤膜板的 LEGENDplex 检测（推荐）
真空过滤装置	EMD Millipore	MSVMHTS00	用于使用滤膜板的 LEGENDplex 检测（推荐）
无菌一次性试剂储液槽	Fisher Scientific	07-200-130	或同等产品
聚丙烯微量 FACS 管	Fisher Scientific	11-842-90	用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）
移液器套装	Fisher Scientific	14-388-100	四种规格移液器（0.2–2 µL，2–20 µL，20–200 µL，100–1000 µL）
多通道移液器	Fisher Scientific	FA10011G	可分配 5 μL 至 200 μL
微孔板振荡器	Fisher Scientific	88880023	或同等产品
微量离心机	Fisher Scientific	75002410	或同等产品
FACS 管	Fisher Scientific	NC9885747	12 × 75 mm 圆底
PMA（佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯）	Sigma-Aldrich	P8139
脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich	L-8274	大肠杆菌 O26:B6
离子霉素	Sigma-Aldrich	I0634
Branson B200 超声波清洗器	Sigma-Aldrich	Z305359	或同等产品
微量离心管	Sigma-Aldrich	Z666505	1.5 mL 聚丙烯管
流式细胞仪	Various	Various	配备单激光（488 nm 蓝光）或双激光（488 nm 蓝光或 532 nm 绿光 + 633 nm 红光），可检测 575 nm 和 660 nm 发射波长的流式细胞仪
96 孔聚丙烯板	VWR	82050-662	用于在微量管、V 型或 U 型底 96 孔板中进行 LEGENDplex 检测（可选）