利用免疫组织化学技术检测脑组织中的异常朊蛋白

摘要

来源：Orge, L.，等。通过免疫组织化学法检测异常朊蛋白。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频演示了一种利用免疫组织化学方法在脑组织切片中检测错误折叠朊蛋白的技术。首先用甲酸处理脑组织切片，以变性朊蛋白并降低感染风险，再通过加热诱导表位修复来暴露朊蛋白聚集体，随后对错误折叠的朊蛋白聚集体进行免疫标记，并在显微镜下观察。

方案

1. 组织切片与载玻片制备

1. 使用切片机对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织进行切片，厚度为 3–5 µm。
2. 将切片漂浮于温度比所用石蜡熔点低约 10 ˚C 的纯净水中。将切片从水中转移至经过特殊处理的显微镜载玻片上（参见材料表）。让水充分从载玻片上流尽。
3. 将载玻片在 50 ˚C 下孵育过夜，以增强组织在载玻片上的附着性。
   注意：建议为免疫组化（IHC）实验流程使用新鲜切片的组织，尽管TSE阳性和阴性对照切片可预先制备并储存。步骤 2 至 4 必须在化学通风橱中进行。

2. 脱蜡与复水

1. 将带有组织切片的玻片放入不锈钢染色架中（参见材料表）。将染色架浸入二甲苯浴（不锈钢染色容器）中3分钟，取出后再浸入一次。
2. 移除二甲苯，通过将切片浸入无水乙醇浴中3分钟进行再水化。取出后再次浸入无水乙醇浴中。
3. 将切片空气干燥，随后放入90%乙醇浴中1分钟。转移至70%乙醇浴中1分钟，最后转移至50%乙醇浴中1分钟。每次乙醇浴处理时，均需轻轻振荡染色架两次，并在转移前将染色架沥干。

3. 抗原表位修复

1. 将组织切片小心浸入98%甲酸中，室温下处理30分钟。用自来水冲洗切片5分钟，随后用蒸馏水冲洗两次。
   注意：甲酸具有强腐蚀性，必须佩戴防护眼镜和手套。
2. 按照以下步骤进行热诱导抗原修复（HIER）。
   注意：本步骤采用水合高压灭菌法，在特定压力舱中于121 °C处理30分钟（参见材料表）。
   1. 将柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1，参见材料表）置于不锈钢染色容器中，并放入装有500 mL蒸馏水的压力舱内，于98 °C预热约20分钟。
      注意：在本研究中，所用特定设备的设定点程序为1（SP1）。
   2. 当警报提示设备已达到预设的时间和温度后，将载玻片篮浸入其中，并启动设定点2程序（121 °C，30分钟）。为质量控制目的，可在篮子上贴一段粘性高压灭菌指示胶带，以监测温度和压力，并记录该程序的初始和最终压力。
   3. 若待免疫染色的载玻片数量未达到篮子容量，应使用洁净的空白载玻片填满空位。程序结束后，让压力舱自然恢复至环境压力（至少30分钟）。
      注意：延长此过程可能降低非特异性背景染色。
   4. 小心将载玻片篮转移至盛有蒸馏水的不锈钢染色容器中，浸泡5分钟。

4. 内源性过氧化物酶的灭活

1. 将含有样本切片的切片架浸入含3%过氧化氢（H₂O₂）的甲醇溶液中，孵育30分钟。用流动水冲洗切片（5分钟）。沥干后，将切片浸入1×Tris缓冲盐水（TBS）中继续孵育5分钟。

5. 免疫检测

注意：本研究中，免疫检测采用市售载玻片夹具系统（见材料表）以毛细间隙法进行。其他免疫组织化学载玻片系统亦可适用。

1. 将每张切片放置于市售的盖板架上（参见材料表），架体预先用TBS润湿，避免产生气泡，组织面朝向架体，切片边缘与架体的两个下端点对齐。
   1. 用拇指和食指夹住切片-架体组件，一指置于样本切片上方，另一指置于架体底部，然后将组件放入系统的染色架槽中。
   2. 为确保组件装配良好，用TBS填充样本切片与架体之间的孔腔，液体不应立即溢出。自此步骤起，需确保架体与切片之间始终保留约80 µL的TBS。切勿让组织切片干燥。
2. 将组件放入系统后，在使用一抗（抗朊蛋白抗体（anti-PrP），参见材料表）处理前，为降低背景染色，需将样本切片在TBS中用20%的正常血清（与后续免疫染色所用二抗宿主相同物种的血清，本实验中为马血清）预孵育30分钟。
3. 根据待分析的动物物种、需检测的样本切片数量以及工作稀释液的用量，解冻相应份数的抗体。
   注意：为获得最佳效果，建议在一抗和二抗溶液中均使用与二抗宿主相同物种的10%正常血清。若条件允许，正常血清与二抗的宿主应来自同一物种。
4. 无需洗涤切片，直接将一抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育60分钟。
5. 洗涤时，用TBS充满切片架组件的各孔，静置5分钟，重复此步骤两次。
6. 将生物素标记的二抗（单克隆抗鼠IgG马源抗体，参见材料表）用含10%马血清的TBS按1:200稀释。根据待处理切片的数量准备所需体积。
7. 将二抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。
8. 按步骤5.5所述方法进行洗涤。
9. 进行链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC/HRP复合物，参见材料表）孵育时，需在使用前30分钟配制试剂。将ABC/HRP复合物溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。
10. 按步骤5.5所述方法进行洗涤。

6. 使用3,3'二氨基联苯胺（DAB）显色剂显色

注意：DAB 是一种潜在的致癌物。因此，在使用该试剂时必须采取适当的防护措施，包括佩戴护目镜、实验服、手套，并遵循良好的实验室操作规范。废弃物应按照当地规定进行处置。

1. 使用前，根据制造商说明（见材料表）稀释显色剂。向每块载玻片-板组的每个孔中加入显色剂溶液（400 µL）。
2. 室温孵育最多30分钟。对于PrP^Sc（朊病毒蛋白的异常异构体）阳性切片，通常孵育10分钟即可。
3. 用蒸馏水洗涤载玻片，去除残留的显色剂溶液。将载玻片从盖板架中取出，放入盛有蒸馏水的塑料容器中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010	未稀释
			用蒸馏水稀释至90%、70%和50%
亲和素-生物素复合物及过氧化物酶 Vectastain Elite ABC 过氧化物酶试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100	根据试剂盒说明书在使用前30分钟配制并轻轻混匀。静置后不得再次混合。
生物素化二抗（马抗小鼠IgG H+L）	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	用含10%正常马血清的TBS按1:200稀释。根据切片数量准备所需体积。
显色底物DAB（二氨基联苯胺）试剂盒，过氧化物酶	Vector Laboratories	SK-4100	根据试剂盒说明书在使用前配制。 每张切片使用400 µL溶液。
DakoCytomation Pascal 压力锅	DAKO	S2800
Ehrlich苏木精染液：
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010
冰醋酸	Merck	101830
钾明矾	Merck	1.01047.1000
甘油	Merck	1.04091.1000
内源性过氧化物酶封闭液（3% H2O2）：			将40 mL过氧化氢（30% w/w）加入360 mL甲醇中。 使用前配制
过氧化氢（30% w/w）	Scharlau	HI0136
甲醇	Sigma Aldrich	322415-2L
甲酸（98%）	Merck	1.00264.1000	未稀释
切片机	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
TBS中的正常血清（20%）封闭液： 正常马血清	Gibco	16050-122	根据检测中切片数量配制最终体积 （每张切片200 µL溶液）。
一抗 anti-PrP 小鼠单克隆抗体 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 适用于绵羊（包括非典型痒病）、鹿、猫，不适用于牛。 根据检测中切片数量（每张切片200 µL溶液）和抗体稀释比例，在TBS中加入10%与二抗同源动物的正常血清（正常马血清）配制最终体积。 常规抗体稀释比例：MAb 2G11 1:100，但每次新批次应优化稀释比例，以获得最强信号和最低背景。储存时，将至少10 μL分装至无菌微量管中冷冻。每次使用时解冻一份。
一抗 anti-PrP 小鼠单克隆抗体 12F10	Cayman Chemical Company	189710	PrP142-160 适用于牛，不适用于绵羊。 常规抗体稀释比例：1:200，但同样需优化工作浓度。配制方法同MAb 2G11。
Shandon Coverplate™ 染色室	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® 免疫染色中心	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® 免疫染色载片架	Thermo Scientific	73310017
柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1）：			将2.55 g 二水合柠檬酸三钠和0.255 g 柠檬酸溶于1升纯化水中。 使用10 mM柠檬酸溶液（将1.05 g柠檬酸溶于500 mL纯化水中）调节工作液pH至6.1。 在实验当天配制。
二水合柠檬酸三钠	Sigma-aldrich	S4641-500G
柠檬酸	Sigma Aldrich	C0759
染色缸及染色篮	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus 显微镜载玻片	VWR	631-0108
Tris缓冲盐水（TBS）（50 mM TRIZMA BASE；0.8% NaCl；pH 7.6）：			10xTBS（储存液：0.5 M TRIZMA BASE；8% NaCl；pH 7.6）： 将60.57 g TRIZMA BASE 和80 g NaCl 溶于800 mL纯化水中，用37%盐酸调节储存液pH，再用纯化水定容至1升（储存于5±3 °C，可保存2个月）。 实验当天将TBS储存液按1:10稀释。
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
氯化钠（NaCl）	Merck	106404
二甲苯	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	未稀释