利用免疫组织化学技术检测脑组织中的异常朊蛋白

摘要

来源：Orge, L.，等。通过免疫组织化学法检测异常朊蛋白。J. Vis. Exp. (2023)。

本视频演示了一种利用免疫组织化学方法在脑组织切片中检测错误折叠朊蛋白的技术。首先用甲酸处理脑组织切片，以变性朊蛋白并降低感染风险，再通过加热诱导表位修复来暴露朊蛋白聚集体，随后对错误折叠的朊蛋白聚集体进行免疫标记，并在显微镜下观察。

方案

1. 组织切片与载玻片制备

1. 使用切片机对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织进行切片，厚度为 3–5 µm。
2. 将切片漂浮于温度比所用石蜡熔点低约 10 ˚C 的纯净水中。将切片从水中转移至经过特殊处理的显微镜载玻片上（参见材料表）。让水充分从载玻片上流尽。
3. 将载玻片在 50 ˚C 下孵育过夜，以增强组织在载玻片上的附着性。
   注意：建议为免疫组化（IHC）实验流程使用新鲜切片的组织，尽管TSE阳性和阴性对照切片可预先制备并储存。步骤 2 至 4 必须在化学通风橱中进行。

2. 脱蜡与复水

1. 将带有组织切片的玻片放入不锈钢染色架中（参见材料表）。将染色架浸入二甲苯浴（不锈钢染色容器）中3分钟，取出后再浸入一次。
2. 移除二甲苯，通过将切片浸入无水乙醇浴中3分钟进行再水化。取出后再次浸入无水乙醇浴中。
3. 将切片空气干燥，随后放入90%乙醇浴中1分钟。转移至70%乙醇浴中1分钟，最后转移至50%乙醇浴中1分钟。每次乙醇浴处理时，均需轻轻振荡染色架两次，并在转移前将染色架沥干。

3. 抗原....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010	未稀释
			用蒸馏水稀释至90%、70%和50%
亲和素-生物素复合物及过氧化物酶 Vectastain Elite ABC 过氧化物酶试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100	根据试剂盒说明书在使用前30分钟配制并轻轻混匀。静置后不得再次混合。
生物素化二抗（马抗小鼠IgG H+L）	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	用含10%正常马血清的TBS按1:200稀释。根据切片数量准备所需体积。
显色底物DAB（二氨基联苯胺）试剂盒，过氧化物酶	Vector Laboratories	SK-4100	根据试剂盒说明书在使用前配制。 每张切片使用400 µL溶液。
DakoCytomation Pascal 压力锅	DAKO	S2800
Ehrlich苏木精染液：
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010
冰醋酸	Merck	101830
钾明矾	Merck	1.01047.1000
甘油	Merck	1.04091.1000
内源性过氧化物酶封闭液（3% H2O2）：			将40 mL过氧化氢（30% w/w）加入360 mL甲醇中。 使用前配制
过氧化氢（30% w/w）	Scharlau	HI0136
甲醇	Sigma Aldrich	322415-2L
甲酸（98%）	Merck	1.00264.1000	未稀释
切片机	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
TBS中的正常血清（20%）封闭液： 正常马血清	Gibco	16050-122	根据检测中切片数量配制最终体积 （每张切片200 µL溶液）。
一抗 anti-PrP 小鼠单克隆抗体 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 适用于绵羊（包括非典型痒病）、鹿、猫，不适用于牛。 根据检测中切片数量（每张切片200 µL溶液）和抗体稀释比例，在TBS中加入10%与二抗同源动物的正常血清（正常马血清）配制最终体积。 常规抗体稀释比例：MAb 2G11 1:100，但每次新批次应优化稀释比例，以获得最强信号和最低背景。储存时，将至少10 μL分装至无菌微量管中冷冻。每次使用时解冻一份。
一抗 anti-PrP 小鼠单克隆抗体 12F10	Cayman Chemical Company	189710	PrP142-160 适用于牛，不适用于绵羊。 常规抗体稀释比例：1:200，但同样需优化工作浓度。配制方法同MAb 2G11。
Shandon Coverplate™ 染色室	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® 免疫染色中心	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® 免疫染色载片架	Thermo Scientific	73310017
柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1）：			将2.55 g 二水合柠檬酸三钠和0.255 g 柠檬酸溶于1升纯化水中。 使用10 mM柠檬酸溶液（将1.05 g柠檬酸溶于500 mL纯化水中）调节工作液pH至6.1。 在实验当天配制。
二水合柠檬酸三钠	Sigma-aldrich	S4641-500G
柠檬酸	Sigma Aldrich	C0759
染色缸及染色篮	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus 显微镜载玻片	VWR	631-0108
Tris缓冲盐水（TBS）（50 mM TRIZMA BASE；0.8% NaCl；pH 7.6）：			10xTBS（储存液：0.5 M TRIZMA BASE；8% NaCl；pH 7.6）： 将60.57 g TRIZMA BASE 和80 g NaCl 溶于800 mL纯化水中，用37%盐酸调节储存液pH，再用纯化水定容至1升（储存于5±3 °C，可保存2个月）。 实验当天将TBS储存液按1:10稀释。
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
氯化钠（NaCl）	Merck	106404
二甲苯	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	未稀释