一种利用抗体微阵列芯片检测蓝细菌菌株的技术

摘要

来源：Blanco, Y. 等，利用抗体微阵列芯片检测液体和固体样品中蓝细菌的实验方案 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用抗体微阵列芯片检测环境样品中蓝细菌菌株的方法。含有多种细菌的样品与固定在芯片上的抗体发生相互作用，通过荧光标记的抗蓝细菌菌株抗体进行免疫染色，可在不同位点观察到特异性荧光信号，从而揭示特定蓝细菌菌株的存在。

方案

1. 免疫原的制备

1. 在 表1所述条件下，于相应的培养基中培养每种蓝细菌菌株。
   注意： 蓝细菌 各菌株的培养基和培养条件列于 表1。除K17外，所有蓝细菌菌株均来自西班牙马德里自治大学Antonio Quesada研究组。抗 Planktothrix rubescens 的抗体由该蓝细菌在中国台湾北部Vilasouto水库形成的单一种群水华自然样品制备获得。
2. 使用血细胞计数板在光学显微镜下对细胞数量进行定量，从对数生长后期或稳定期的培养物中获得约10⁸ 个细胞/mL。
3. 取5 mL培养物，在2,000 × g离心5分钟，收集细胞。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于10 mL离心管中的5 mL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，使细胞浓度约为10⁸ 个细胞/mL。
5. 使用便携式手持超声波破碎仪，对细胞悬液进行超声处理，共5个循环，每个循环30秒，每次超声后在冰上静置30至60秒；或使用细胞破碎仪的水浴装置，将离心管浸入其中，以最大振幅（30 kHz）进行处理，以实现细胞的均质化和裂解。
6. 对每种蓝细菌菌株重复步骤1.3至1.5。
   注意：超声处理可导致细胞破裂并释放细胞内容物。虽然蛋白质和多糖是良好的免疫原，但某些特定分子（如脂类和核酸）本身无法诱导体液免疫应答，因此必须与多糖或蛋白质等载体结合，以增加其分子复杂性。此外，超声处理可释放细胞内物质，从而激发抗体的产生。

2. 多克隆抗体的制备

1. 将步骤 1.5 中获得的超声处理后的细胞裂解液 0.5 mL 与 0.5 mL 完全弗氏佐剂混合，制备第一剂免疫原。将其交予动物设施的操作人员用于多克隆兔抗体的制备。
2. 按照上述方法再制备三剂，用于抗体生产过程中的加强免疫：将步骤 1.5 中获得的相同匀浆/裂解液 0.5 mL 与 0.5 mL 不完全弗氏佐剂混合。将这些制剂交给动物设施以完成抗体生产流程。
3. 每次开展新的抗体生产流程时，均需重复步骤 2.1 和 2.2。         
   注意：通常，抗体生产会委托给专业的动物设施或公司，因为动物实验需要相应的许可资质和专业培训。相关公司会提供血清样本中抗原特异性抗体相对含量的酶联免疫吸附测定（ELISA）检测结果。

3. 抗体纯化

1. 通过蛋白A亲和层析法，从第2步收集的免疫血清和免疫前血清中纯化免疫球蛋白G（IgG）组分。某些基于柱式系统的商用纯化试剂盒效果良好；请遵循供应商提供的说明进行操作。
2. 若纯化试剂盒未提供脱盐系统，则在洗脱纯化后的抗体后，通过透析或使用具有100 kDa（或更小）膜孔径的离心过滤装置，将缓冲液置换为0.1× PBS。
3. 通过测量280 nm处的吸光度，或使用比色法（如Bradford法、Lowry法或双辛可宁酸BCA法）测定抗体浓度。
   注意：应避免在洗脱缓冲液中包含氨基基团（例如 Tris缓冲液），因为它们会与抗体竞争结合环氧基团活化的固相表面。纯化后，必须使用ELISA检测抗体活性。

4. 荧光抗体标记

1. 将第3部分中获得的纯化抗体用荧光染料（例如 远红光荧光染料）进行标记：将一管可标记1 mg蛋白质的商用染料溶解于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中，然后向每份浓度为2 mg/mL、终体积为50 µL的抗体溶液中加入2 µL上述染料溶液（溶于50 mM磷酸盐缓冲液，pH 8.5）。
2. 将标记反应液置于振荡平台上，在室温、1,200 rpm条件下持续震荡孵育1小时。
3. 通过尺寸排阻色谱法纯化标记后的抗体（例如 使用截留分子量范围为1.5至30 kDa的凝胶填充柱），并按照试剂供应商的建议进行操作。
4. 测定洗脱液在280 nm和650 nm处的吸光度，并根据供应商建议计算标记效率。
   注意：一管可标记1 mg蛋白质的荧光染料最多可用于50次50 µL的抗体标记反应。建议在步骤4.3之后用铝箔包裹反应管，或使用不透光的0.5 mL离心管，以避免荧光淬灭。对于IgG抗体，每摩尔抗体标记3–7摩尔染料时可达到最佳标记效果。

5. CYANOCHIP 的生产

1. 打印溶液中的抗体与对照
   1. 准备30 µ每种纯化抗体在打印溶液中的终浓度为1 mg/mL，将每种抗体溶于含0.01% (v/v) Tween 20（一种非离子型去污剂）的商用1×蛋白质打印缓冲液中，混匀后使用。
      注意：或者，抗体溶液可包含20%甘油、1% (w/v) 蔗糖（或海藻糖，作为防腐剂）和0.01% (v/v) Tween 20，溶于碳酸盐缓冲液（pH 8.5）中。
   2. 准备30 µ作为对照的打印溶液：（a）含0.01% (v/v) Tween 20的1×蛋白打印缓冲液；（b）用含0.01% (v/v) Tween 20的1×蛋白打印缓冲液稀释至1 mg/mL的蛋白A纯化前免疫血清；（c）用含0.01% (v/v) Tween 20的1×蛋白打印缓冲液稀释至1 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）。
   3. 准备30 µ不同浓度的荧光标记纯化前免疫血清 L例如， 从50 µg/mL 至 1 µg/mL）加入含 Tween 20 的 1× 蛋白质点样缓冲液中，步骤同 5.1.1。这些样品将用于点样后作为荧光定位标记及相对荧光强度定量。
   4. 加入30 µ将按步骤 5.1.1、5.1.2 和 5.1.3 配制的打印溶液各 L 加入用于微阵列制造的高质量 384 孔微孔板（如聚丙烯材质）中。 
      注意蛋白质打印缓冲液可提高抗体的质量和稳定性，Tween 20 可均一化斑点形态并促进蛋白质偶联。建议将 384 孔微孔板保存在 4 ℃ °使用前置于 C。于 -20 保存 °长时间保持在 C。聚丙烯具有较低的 DNA、蛋白质、细胞提取物和小分子固有结合性。
2. 将抗体点样至显微镜载玻片
   注意使用不同的阵列平台，如接触式、分针式或非接触式设备（例如压电式打印机或“喷墨”技术），将抗体打印到活化的显微镜载玻片上。在本研究中，CYANOCHIP 常规采用接触式方法，使用能够点样纳升级（nL）抗体的机器人系统（点样仪）进行打印 µ微米尺度。
   1. 将打印室的环境条件设置为20 °C 和 40 - 50% 相对湿度。
   2. 设置载玻片基底（例如， 75 mm × 25 mm 环氧活化显微镜载玻片，用于在每张载玻片上进行多个相同的抗体阵列实验。
   3. 将每种纯化的抗体（包括对照和参考框架）以三份点样模式点样；在此条件下，点样斑点直径为180 - 200 µ毫米直径。
   4. 打印后，将载玻片在室温下静置至少30分钟使其干燥，然后于4℃保存 °C；在野外工作时，载玻片可在室温下运输和保存数月。
      注意CYANOCHIP 以三重复点样微阵列格式打印，每张载玻片包含 3 x 8 个相同的微阵列，或采用 1 x 9 微阵列格式包含 9 个相同的阵列。每个阵列的尺寸不得超过 24 孔垫片反应室的尺寸（通常在 3 x 8 杂交室中为 7.5 x 6.5 mm）。
   5. 在使用微阵列分析环境样品之前，应采用荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI）通过滴定曲线确定每种抗体的工作稀释度。对于每种抗体，使用相应免疫原的标准浓度（10³ - 10⁴ 细胞/mL）以及荧光抗体的系列稀释液（稀释比例为1:500至1:32,000）。最适抗体浓度对应于滴定曲线上最大信号强度的50%。此外，每种抗体的灵敏度和特异性也必须确定，具体方法如Blanco所述。 等

6. 荧光三明治微阵列免疫分析法（FSMI）用环境多分析物提取物的制备

1. 从液体样品中提取多组分分析物
   1. 使用无菌注射器取 1 - 100 mL 液体样品（例如 水库岸边的水样）；取样量在很大程度上取决于目标物的潜在浓度。
   2. 将水样通过孔径为 3 µm、直径为 47 mm 的聚碳酸酯滤膜，以浓缩细胞；理想的细胞浓度范围为 10³ - 10⁸ 个细胞/mL，以便实现阳性检测，但实际浓度未知。
   3. 用 1 mL 改良的含 Tween 20 增强型 Tris 缓冲盐水（TBSTRR；0.4 M Tris-HCl (pH 8)，0.3 M NaCl，和 0.1% Tween 20）冲洗滤膜，借助刮刀将收集的生物物质刮入 15 mL 离心管中。
   4. 使用手持式超声处理器进行均质和分散（操作如步骤 1.5 所述），或仅通过反复吹打实现；此步骤为后续微阵列分析做准备。
2. 从固体样品中提取多组分分析物
   1. 称取最多 0.5 g 固体样品（例如 岩石、土壤或沉积物）至 10 mL 离心管中，并加入最多 2 mL TBSTRR。
   2. 将超声探头浸入管中，或将离心管浸入强力超声水浴中，或使用手持式超声仪进行超声处理。在冰上进行至少 5 次、每次 30 秒的超声循环，每次间隔 30 秒。
   3. 使用连接 10 mL 注射器的尼龙滤器（直径 10 至 12 mm，孔径 5 至 20 µm）过滤，以去除沙粒、黏土及其他粗颗粒物质。将样品推过滤膜进入 1.5 mL 离心管中。若滤膜堵塞，可振荡注射器内的悬浮液并更换新滤膜；此步骤为后续免疫分析（步骤 7）准备滤过物。
      注意：TBSTRR 的缓冲能力取决于样品类型。为避免酶降解对分析物的影响，应在环境提取物制备完成后立即进行免疫分析。或者，可在环境提取物中加入蛋白酶抑制剂，并于 -80 °C 冻存，直至进行下一步操作。

7. 荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI）

1. 封闭 CYANOCHIP
   注意：使用前立即处理打印好的芯片，以封闭载玻片上所有游离的环氧基团，并去除非共价结合的过量抗体。
   1. 将微阵列浸入含有5% (w/v) BSA的0.5 M Tris-HCl (pH 9) 溶液中，置于洁净表面（例如 培养皿或50-mL离心管），在摇床平台上轻微振荡5分钟。或者，将芯片点阵面朝下放置于100–200 µL上述溶液液滴上，静置3–5分钟，随后进行下一步操作。
   2. 使用带塑料尖头的镊子小心夹取芯片，尽量避免接触微阵列区域。轻轻敲击芯片至吸水纸上以去除多余液体。随后将其浸入含2% (w/v) BSA的0.5 M Tris-HCl (pH 8) 溶液中，在摇床平台上轻微振荡孵育30分钟。
   3. 使用适用于显微镜载玻片的商用微量离心机进行短时离心（200–300 × g，1分钟）干燥芯片。或者，可通过轻轻敲击至吸水纸上来干燥芯片。
2. 多分析物样品提取液与微阵列的孵育
   1. 将芯片放入商用微阵列杂交盒（含24个孔，可容纳多个微阵列），并按照供应商说明进行操作。
   2. 完成芯片与杂交盒组装后，向每个孔中加入最多50 µL样品提取液或其在TBSTRR缓冲液中的稀释液。
   3. 对每个待分析样品重复步骤7.2.2。
   4. 作为空白对照，向杂交盒中至少两个独立的孔内各加入50 µL TBSTRR缓冲液。
   5. 在室温下孵育1小时，期间每15分钟用移液器吹打混匀一次，或保持轻微振荡。或者，在4 °C下孵育12小时。
      注意：根据微阵列的排列模式选择合适的孵育密封垫。步骤7.2.5中的孵育时间和温度为经验参数，通常取决于每对抗原-抗体之间的亲和力和结合动力学。
3. 洗涤
   1. 将杂交盒倒置并轻轻敲击于洁净的吸水纸上，以去除孔内样品。
   2. 向每个孔中加入150 µL TBSTRR缓冲液进行洗涤，并如上法去除缓冲液。
   3. 重复步骤7.3.2三次。
4. 与荧光检测抗体孵育
   1. 向每孔加入50 µL抗体混合液，其中包含17种抗蓝藻菌株抗体，每种抗体均用荧光染料标记，并溶于含1% (w/v) BSA的TBSTRR缓冲液中。通过各抗原/抗体对的滴定实验确定混合液中每种荧光抗体的浓度（范围为0.7–2 µg/mL） 。
   2. 在室温下孵育1小时（操作同步骤7.2.5），或在4 °C下孵育12小时。
5. 洗去未结合的荧光抗体
   1. 按照步骤7.3的方法去除未结合的荧光抗体。
   2. 拆卸杂交盒，并将芯片浸入0.1x PBS缓冲液中（例如 置于50-mL离心管内）快速漂洗。
   3. 按照步骤7.1.3的方法干燥芯片。

8. 荧光扫描

1. 使用荧光扫描仪在远红荧光染料的最大发射荧光峰处对载玻片进行荧光扫描。通过降低激光增益值等不同扫描参数，获取微阵列的多张图像。
   注意：避免出现饱和信号点（> 65,000 荧光计数）——此类信号超出量程，可能导致定量误差。

表1. 用于制备CYANOCHIP的抗体（Abs）及Cyanobacterial菌株列表。

抗体编号	免疫原（菌株）	目	生境	培养基	培养条件
K1	Anabaena sp.	Nostocales	未知	BG11 和硝酸盐	30 ºC，连续光照
K2	Anabaena sp.	Nostocales	未知	BG11o	30 ºC，连续光照
K3	Microcystis flosaquae	Chroococcales	浮游	BG11	28 ºC，连续光照
K4	Microcystis novacekii	Chroococcales	浮游	BG11	28 ºC，连续光照
K5	Microcystis aeruginosa	Chroococcales	浮游	BG11	28 ºC，连续光照
K6	Aphanizomenon ovalisporum	Nostocales	浮游	BG11o	28 ºC，连续光照
K7	Phormidium sp.	Oscillatoriales	底栖	BG11	18 ºC，16-8 光照周期
K8	Rivularia sp.	Nostocales	底栖	CHU-D	18 ºC，16-8 光照周期
K9	Chamaesiphon sp.	Chroococcales	底栖	BG11	18 ºC，16-8 光照周期
K10	Leptolyngbya boryana	Oscillatoriales	底栖	BG11	18 ºC，16-8 光照周期
K11	Tolypothrix distorta	Nostocales	底栖	BG11o	18 ºC，16-8 光照周期
K12	Aphanizomenon aphanizomenoides	Nostocales	浮游	BG11o	28 ºC，连续光照
K13	Nostoc sp. (Antarctica)	Nostocales	底栖	BG11o	13 ºC，16-8 光照周期
K14	Anabaena sp.	Nostocales	底栖	BG11o	13 ºC，16-8 光照周期
K15	Leptolyngbya sp.	Oscillatoriales	底栖	BG11	13 ºC，16-8 光照周期
K16	Tolypothrix sp.	Nostocales	底栖	BG11	13 ºC，16-8 光照周期
K17	Planktothrix rubescens	Oscillatoriales	浮游	无	无

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 mm 孔径滤器	Millipore	GSWP04700	用于免疫原制备
Eppendorf  5424R 微型离心机	Fisher Scientific		用于免疫原制备
磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM 磷酸钾，150 mM NaCl，pH 7.4
超声波处理器 UP50H	Hielscher		用于免疫原制备
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	免疫增强剂
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	用于加强免疫注射
Protein A 抗体纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	PURE1A	用于 IgG 分离
离心过滤装置 MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	用于 IgG 分离
苯甲酰化透析管	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	用于 IgG 分离
Illustra Microspin G-50 柱	GE-HealthCare	GE27-5330-02	用于 IgG 分离
Bradford 试剂	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	用于定量抗体浓度
MicroBCA 蛋白测定试剂盒	Thermo Scientific	23235	用于定量抗体浓度
蛋白点样缓冲液 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	打印缓冲液；含 0.01% Tween 20 的 1X PBS 中含 30-40% 甘油
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	非离子型去污剂
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	打印对照 ；封闭试剂
384 孔微孔板	Genetix	X6004	用于抗体点样
多片载玻片机器人点样仪	Digilab MicroGrid II TAS 点样仪		用于抗体点样
环氧基底玻璃载片	Arrayit corporation	VEPO25C	抗体点样的固体支持物
Alexa Fluor-647 琥珀酰亚胺酯	Molecular probes	A20006	荧光染料
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	荧光染料溶剂
Heidolph Titramax 振荡平台摇床	Fisher Scientific		用于抗体标记
Illustra Microspin G-50 柱	Healthcare	27-5330-01	用于纯化标记抗体
Safe seal 棕色 0.5 ml 管	Sarstedt	7,27,04,001	用于储存标记抗体
Nanodrop 1000 分光光度计	Thermo Scientific		用于定量抗体浓度和标记效率
3 µm 孔径聚碳酸酯滤膜，直径 47 mm	Millipore	TMTP04700	用于浓缩细胞
1M Trizma 盐酸溶液 pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	用于 TBSTRR 制备；封闭载片
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用于 TBSTRR 制备
20 µm 尼龙滤膜	Millipore	NY2004700	用于环境提取物制备
10-12 mm 滤器支架	Millipore	SX0001300	用于环境提取物制备
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	用于环境提取物储存
1M Trizma 盐酸溶液 pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	用于封闭载片
Heidolph Duomax 1030 摇床	VWR		用于封闭载片；孵育过程
VWR Galaxy miniarray 微型离心机	VWR	C1403-VWR	用于干燥载片
多孔微阵列杂交盒	Arrayit corporation	AHC1X24	每张载片可进行 24 个检测的盒式装置
GenePix 4100A 微阵列扫描仪	Molecular Devices		荧光扫描仪
GenePix Pro 软件	Molecular Devices		用于图像分析和定量的软件