一种利用抗体微阵列芯片检测蓝细菌菌株的技术

摘要

来源：Blanco, Y. 等，利用抗体微阵列芯片检测液体和固体样品中蓝细菌的实验方案 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种利用抗体微阵列芯片检测环境样品中蓝细菌菌株的方法。含有多种细菌的样品与固定在芯片上的抗体发生相互作用，通过荧光标记的抗蓝细菌菌株抗体进行免疫染色，可在不同位点观察到特异性荧光信号，从而揭示特定蓝细菌菌株的存在。

方案

1. 免疫原的制备

1. 在 表1所述条件下，于相应的培养基中培养每种蓝细菌菌株。
   注意： 蓝细菌 各菌株的培养基和培养条件列于 表1。除K17外，所有蓝细菌菌株均来自西班牙马德里自治大学Antonio Quesada研究组。抗 Planktothrix rubescens 的抗体由该蓝细菌在中国台湾北部Vilasouto水库形成的单一种群水华自然样品制备获得。
2. 使用血细胞计数板在光学显微镜下对细胞数量进行定量，从对数生长后期或稳定期的培养物中获得约10⁸ 个细胞/mL。
3. 取5 mL培养物，在2,000 × g离心5分钟，收集细胞。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于10 mL离心管中的5 mL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，使细胞浓度约为10⁸ 个细胞/mL。
5. 使用便携式手持超声波破碎仪，对细胞悬液进行超声处理，共5个循环，每个循环30秒，每次超声后在冰上静置30至60秒；或使用细胞破碎仪的水浴装置，将离心管浸入其中，以最大振幅（30 kHz）进行处理，以实现细胞的均质化和裂解。
6. 对每种蓝细菌菌株重复步骤1.3至....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 mm 孔径滤器	Millipore	GSWP04700	用于免疫原制备
Eppendorf  5424R 微型离心机	Fisher Scientific		用于免疫原制备
磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM 磷酸钾，150 mM NaCl，pH 7.4
超声波处理器 UP50H	Hielscher		用于免疫原制备
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	免疫增强剂
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	用于加强免疫注射
Protein A 抗体纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	PURE1A	用于 IgG 分离
离心过滤装置 MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	用于 IgG 分离
苯甲酰化透析管	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	用于 IgG 分离
Illustra Microspin G-50 柱	GE-HealthCare	GE27-5330-02	用于 IgG 分离
Bradford 试剂	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	用于定量抗体浓度
MicroBCA 蛋白测定试剂盒	Thermo Scientific	23235	用于定量抗体浓度
蛋白点样缓冲液 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	打印缓冲液；含 0.01% Tween 20 的 1X PBS 中含 30-40% 甘油
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	非离子型去污剂
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	打印对照 ；封闭试剂
384 孔微孔板	Genetix	X6004	用于抗体点样
多片载玻片机器人点样仪	Digilab MicroGrid II TAS 点样仪		用于抗体点样
环氧基底玻璃载片	Arrayit corporation	VEPO25C	抗体点样的固体支持物
Alexa Fluor-647 琥珀酰亚胺酯	Molecular probes	A20006	荧光染料
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	荧光染料溶剂
Heidolph Titramax 振荡平台摇床	Fisher Scientific		用于抗体标记
Illustra Microspin G-50 柱	Healthcare	27-5330-01	用于纯化标记抗体
Safe seal 棕色 0.5 ml 管	Sarstedt	7,27,04,001	用于储存标记抗体
Nanodrop 1000 分光光度计	Thermo Scientific		用于定量抗体浓度和标记效率
3 µm 孔径聚碳酸酯滤膜，直径 47 mm	Millipore	TMTP04700	用于浓缩细胞
1M Trizma 盐酸溶液 pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	用于 TBSTRR 制备；封闭载片
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用于 TBSTRR 制备
20 µm 尼龙滤膜	Millipore	NY2004700	用于环境提取物制备
10-12 mm 滤器支架	Millipore	SX0001300	用于环境提取物制备
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	用于环境提取物储存
1M Trizma 盐酸溶液 pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	用于封闭载片
Heidolph Duomax 1030 摇床	VWR		用于封闭载片；孵育过程
VWR Galaxy miniarray 微型离心机	VWR	C1403-VWR	用于干燥载片
多孔微阵列杂交盒	Arrayit corporation	AHC1X24	每张载片可进行 24 个检测的盒式装置
GenePix 4100A 微阵列扫描仪	Molecular Devices		荧光扫描仪
GenePix Pro 软件	Molecular Devices		用于图像分析和定量的软件