三维水凝胶系统中包封细胞的免疫染色

摘要

来源：LeSavage, B. L.，等。用于三维细胞包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种对包埋在三维水凝胶中的细胞进行免疫染色的技术。含有神经前体细胞的水凝胶培养物经固定、通透化处理，并用封闭液处理以防止非特异性免疫染色。加入针对特定蛋白的一抗混合物，随后加入荧光标记的二抗和细胞核染料。最后将样品封片并置于共聚焦显微镜下观察。

方案

1. 细胞在三维弹性蛋白样蛋白（ELP）水凝胶中的包封

1. 硅胶模具的制备
   1. 使用所需直径的活检打孔器在厚度为0.5 mm的硅胶片上打孔，并在每个孔周围剪出方形。根据所需模具数量重复操作。
      ​注意：模具的直径和厚度可根据具体应用和细胞培养条件进行调整。实践中，对于50 × 10⁶ 个细胞/mL的细胞培养，建议分别使用厚度为0.5 mm、直径为4 mm和5 mm的模具，以充分提取DNA/RNA和蛋白质。对于免疫染色，可使用直径为2 mm的活检打孔器，在每个方形模具上制作三个相邻的孔，以便每个孔板孔中可进行三个重复染色。
   2. 用镊子去除单个模具两侧的塑料薄膜。
      注意：避免接触暴露的硅胶表面，以免污染降低后续等离子体键合效率。
   3. 使用镊子将相同数量的裸硅胶模具和玻璃盖玻片（No. 1，直径12 mm）交替排列在48孔板倒置的盖子上。完成后，盖上48孔板盖子以避免污染。
   4. 对整个48孔板盖子（即，模具和玻璃载片）进行氧气等离子体处理。处理后立即用镊子将硅胶模具翻转并贴附到相邻的玻璃盖玻片上。用力按压模具以确保键合牢固。让模具在室温下孵育1小时。
      注意：氧气等离子体处理时间会因所用仪器不同而有所变化。本实验所用仪器的典型条件为：工作气压范围0.3–4 mbar，氧气流速20 cm³/min，样品暴露于等离子体10–20秒。
   5. 通过高压灭菌对模具进行灭菌。将模具在室温下保存于无菌环境中，直至使用。
      注意：此阶段的模具可长期保存。
2. 弹性蛋白样蛋白储备液的制备​
   1. 从4 °C保存条件下取出冻干的ELP。在打开管盖前将蛋白升温至室温，以确保在多次使用过程中蛋白表面不会产生冷凝水。
   2. 在4 °C条件下，将ELP溶于Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）中，并持续搅拌（即，旋转）过夜。
      注意：ELP储备液的浓度将在加入交联剂溶液后进一步稀释，稀释比例由用户自定义。例如，若最终ELP浓度为3%（w/v），则应配制3.75%（w/v）的ELP储备液，并以4:1的体积比（ELP溶液:交联剂溶液）进行稀释。根据具体应用需求调整浓度。
   3. 使用0.22 µm注射器滤器对ELP储备液进行无菌过滤。未使用时将ELP置于冰上保存。
3. 在生物安全柜中，使用无菌镊子将灭菌后的模具转移至24孔组织培养板中。
4. 四（羟甲基）磷氯化物（THPC）储备液的制备​
   1. 在使用前立即用DPBS稀释THPC。根据最终ELP浓度和所需的交联比例调整THPC溶液的浓度。
      注意：在本方案中，通过以4:1的体积比混合ELP储备液与THPC溶液，获得最终3%（w/v）的ELP浓度。可根据需要进行调整。
   2. 将2.6 µL THPC溶液（80%水溶液）加入997.4 µL DPBS中。
      注意：该THPC浓度对应于在所述4:1体积比混合条件下，THPC上的羟甲基与ELP蛋白上的伯胺之间1:1的化学计量比，最终形成3%（w/v）的ELP水凝胶。THPC溶液黏稠，液滴可能粘附在移液枪头壁上。为确保准确浓度，在稀释至DPBS时应避免此类液滴残留。向THPC原液容器中通入氮气以防止膦基氧化及交联剂失活。
   3. 涡旋混合溶液，并置于冰上保存。
   4. 使用0.22 µm注射器滤器对THPC储备液进行无菌过滤。根据需要，用无菌DPBS进一步稀释THPC储备液，以获得较低的化学计量交联比（例如，0.5:1或0.75:1）。
      注意：THPC对氧气敏感，稀释后的溶液应在配制后数小时内使用完毕。
5. 使用胰蛋白酶-EDTA孵育使细胞解离为单细胞悬液，离心收集细胞，并用血细胞计数板对悬浮于培养基中的细胞进行计数。
   注意：此步骤的具体方案将高度依赖于目标细胞类型和应用。在本方案中使用的神经前体细胞，采用0.025%胰蛋白酶-EDTA在室温下孵育1.5分钟，随后在200 × g下离心2分钟。为提高细胞存活率，细胞应悬浮于正常培养条件下。用于细胞包封的典型细胞密度范围为每毫升最终水凝胶体积含1–50 × 10⁶个细胞。可根据需要进行调整。
6. 将所需数量的细胞分装至无菌1.5 mL离心管中。
7. 在约200 × g下离心3分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀置于冰上保存。
   注意：必须彻底吸除所有上清液，以避免ELP和THPC交联剂的进一步稀释。具体离心速度会因细胞类型而异。
8. 将细胞沉淀重悬于ELP储备液中，使其体积占最终体积的80%（假设ELP溶液与THPC溶液的体积比为4:1）。吹打混合20–25次，使细胞与ELP均匀混合。
   注意：避免用手握住管底，以防温度升高导致ELP发生相变。每个带有三个重复孔的2 mm模具需要7.5 µL的最终体积（即，6 µL ELP储备液和1.5 µL THPC储备液），平均分配至3个孔中（即，每孔2.5 µL最终体积）。对于4 mm和5 mm模具，分别需要7.5 µL和15.5 µL的最终体积。
9. 向细胞/ELP悬液中加入THPC储备液，补足剩余20%的最终体积。吹打混合20–25次，确保混合均匀。
10. 立即以环形方式将相应最终体积的细胞/ELP/THPC混合液加入各模具中。对所有模具重复此操作。
11. 将样品在室温下孵育15分钟，随后在37 °C下继续孵育15分钟。
    注意：第一次孵育有助于在升温至ELP的低临界溶解温度（LCST）以上之前完成水凝胶的初步交联，并诱导其发生热致相分离。
12. 缓慢向24孔板的每个孔中加入750 µL预热的细胞培养基，注意避免破坏凝胶。
13. 将水凝胶在37 °C下孵育7天。
    注意：建议根据细胞类型每1–2天更换一次完全培养基。为减少对凝胶的扰动，在从孔中吸除培养基时应使用连接200 µL移液枪头的玻璃巴斯德吸管。

2. 三维ELP水凝胶中细胞的免疫细胞化学

1. 通过将10 mL 16% (w/v) 多聚甲醛（PFA）与30 mL DPBS混合配制固定液，并将溶液预热至37 °C。
2. 从24孔板中吸除培养基，并用1 mL DPBS轻轻洗涤。
3. 向每孔加入750 µL固定液，在37 °C孵育30分钟。请勿使用组织培养箱，以避免PFA蒸气污染其他培养物。
4. 小心吸除每孔中的固定液，并将PFA废液弃入适当的危险废物容器。
   注意：接触PFA可能引起皮肤和眼睛刺激。操作时应佩戴手套和护目镜，并在化学通风橱中进行。
5. 向每个样本加入1 mL DPBS。立即吸除DPBS，并弃入PFA废液容器中。
6. 用1 mL DPBS对样本洗涤两次，每次10分钟。
   注意：使用Parafilm密封后，样本可在4 °C的DPBS中保存最多一周。
7. 每孔加入750 µL通透液（100 mL DPBS加0.25 mL Triton X-100；即PBST），在室温下以15 rpm振荡孵育1小时，进行通透处理。
8. 吸除PBST，向每个样本加入750 µL封闭液（95 mL PBS、5 g牛血清白蛋白（BSA）、5 mL血清和0.5 mL Triton X-100）。在室温下以15 rpm振荡孵育3小时。
   注意：封闭液中应包含与二抗宿主物种相同的血清（例如，山羊、驴），并在使用前经0.22 µm滤膜无菌过滤。
9. 配制抗体稀释液（97 mL DPBS、2.5 g BSA、2.5 mL血清（与EPL制备所用宿主物种相同）和0.5 mL Triton X-100）。用抗体稀释液稀释一抗，每孔加入500 µL稀释液。用Parafilm密封后，在4 °C下以振荡方式过夜孵育。
   注意：Nestin和Sox2一抗按厂家原始浓度以1:400比例稀释于抗体稀释液中。
10. 从每个样本中吸除抗体溶液，并在室温下以15 rpm振荡用PBST洗涤60分钟。重复该洗涤步骤3次。
11. 用抗体稀释液稀释二抗及5 mg/mL储备液DAPI（1:2,000），每孔加入500 µL稀释液。用铝箔包裹24孔板，在4 °C下以振荡方式过夜孵育。
    注意：由于二抗对光敏感，后续所有步骤均需避光以防止荧光淬灭。山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗按厂家原始浓度以1:500比例稀释于抗体稀释液中。
12. 从每个样本中吸除抗体溶液，并在室温下以15 rpm振荡用PBST洗涤30分钟。重复该洗涤步骤3次。
13. 在载玻片表面滴加一滴硬封片剂。用镊子夹住模具边缘，在纸巾上轻轻吸去多余液体。小心将模具倒置贴附于封片剂上，避免产生气泡。
14. 在室温下静置48小时使封片剂完全固化。样本可储存于室温或4 °C。成像前应确保封片剂充分固化（至少48小时），因为封片剂的折射率在固化过程中会发生变化。用透明指甲油将样本与盖玻片边缘密封，以防污染或样本移位。
15. 使用共聚焦显微镜对样本进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三维ELP水凝胶中的细胞包封
0.22 μm 注射器滤器	Millipore	SLGV004SL
0.5 mm 厚硅胶片	Electron Microscopy Science	70338-05
24孔组织培养板	Corning	353047
一次性活检打孔器（2 mm）	Integra Miltex	33-31
一次性活检打孔器（4 mm）	Integra Miltex	33-34
一次性活检打孔器（5 mm）	Integra Miltex	33-35
Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Corning	21-031-CM
12 mm 盖玻片（No. 1）	Thermo Fisher Scientific	12-545-80
四（羟甲基）磷鎓氯化物（THPC）	Sigma-Aldrich	404861-100ML
0.5% 胰蛋白酶/EDTA	Thermo Fisher	15400054
三维ELP水凝胶中细胞的免疫细胞化学染色
16% (w/v) 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15701
牛血清白蛋白（BSA）	Roche	3116956001
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Molecular Probes	D1306
驴血清	Lampire Biological Labs	7332100
山羊抗小鼠二抗（AF488）	Molecular Probes	A-11017
山羊抗兔二抗（AF546）	Molecular Probes	A-11071
山羊血清	Gibco	16210-072
小鼠Nestin一抗	BD Pharmingen	556309
小鼠Sox2一抗	Cell Signaling Technology	23064S
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Vectashield Hardset 封片介质	Vector Labs	H-1400