评估病毒来源的肽修饰抗体偶联物的细胞内分布

摘要

来源:Beaudoin， S. et al.， 用病毒衍生肽修饰的抗体偶联物增加细胞积累和改善肿瘤靶向的初步评估。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频演示了使用共聚焦显微镜评估病毒衍生肽修饰抗体偶联物的细胞内分布的过程。病毒来源的核定位序列指导细胞质内的抗体偶联物，通过免疫染色和荧光测量进行确认。

方案

1. 抗体肽偶联

注意:与 NLS 相连的胆酸 （ChAcNLS） 可以在任何商业多肽制造商或大学附属多肽合成服务平台上合成。

1. 在 1.7 mL 微量离心管中，制备 10 mg/mL（~1 mg 总抗体）的 7G3 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液，pH 值为 7.6。
2. 将磺基琥珀酰亚胺基 4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯 （sulfo-SMCC） 溶解在浓度为 5-10 mM 的二甲基亚砜 （DMSO） 中。彻底涡旋溶液以实现完全溶解效果最佳。
3. 将溶解的硫-SMCC 溶液（通常在 5-20 μL 之间，具体取决于所需的磺基-SMCC-与-7G3 的摩尔比）添加到含有 7G3 的试管中。建议检测 sulfo-SMCC 与 7G3 的比率为 10、25 和 50:1。在室温下孵育 1 小时。
4. 通过使用超滤装置和在 PBS（pH 7.0）中更换缓冲液来纯化和浓缩马来酰亚胺衍生的 7G3。以 8,000 x g 离心约 5 分钟。弃去流通液，填充 PBS（pH 值为 7.0），然后再次离心。
   1. 执行此 7-8 次以完全更换缓冲液。通过将过滤装置倒置在干净的微量离心管中来回收浓缩的 7G3 蛋白。以 1,000 x g 离心 2 分钟。回收体积应约为 0.3 mL。
5. 在含有马来酰亚胺活化的 7G3 的试管中，加入相对于上一步中使用的磺基-SMCC 与 7G3 比率的 2 倍摩尔过量的 ChAcNLS，并在 4 °C 下孵育过夜。例如，如果使用 10 比 1 的 sulfo-SMCC 与 7G3 比率，则使用 20 比 1 的 ChAcNLS 与 7G3 比率。总体积不应发生显著变化。
   注意:尽管 ChAcNLS 在偶联过程中不会引起沉淀，但其他肽段也可能发生沉淀。在反应过程中观察试管是否有沉淀迹象，这很可能是由于肽具有疏水性而引起的。在这些情况下，可能值得重新审视感兴趣的肽，以便设计更改以提供更高的亲水性。
6. 使用超滤装置将 7G3-ChAcNLS 浓缩至所需浓度，并在 PBS pH 7.4 中更换缓冲液（参见步骤 1.4）。总蛋白的回收率应≥原始起始材料的 75%。
7. 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 以使用 12% 聚丙烯酰胺凝胶评估构建的 7G3-ChAcNLS 候选物（提供 ChAcNLS 共轭重链和轻链与非共轭链的充分分离）。将 10 μg 7G3-ChAcNLS 与含有 2 μL β-巯基乙醇的 PAGE 上样缓冲液混合，然后上样到孔中。
8. 设置适当的电压（12% 凝胶为 120 V，持续 1 小时）并运行电泳。当考马斯染料前沿到达凝胶底部时停止电泳。
   注意:不要让考马斯染料正面从凝胶上流走。
9. 从电泳仪中取出凝胶，用含有 10% v/v 冰醋酸和 20% v/v 甲醇的脱色溶液冲洗。
10. 用尺子拍下凝胶的照片，测量标准品和 7G3 偶联物的迁移距离 （cm）。计算保留因子 （Rf） 值，即迁移距离除以凝胶长度（从蛋白质上样到考马斯迁移前沿的位置）。将分子量 （MW） 对数与每个蛋白质标准品的 Rf 值作图，并推断 7G3 偶联物的大小。
11. 通过将 7G3 偶联物和未修饰的 7G3 之间的 MW 差除以 1768.5 g/mol（ChAcNLS 的 MW）来计算每种抗体的肽数。
12. 拍摄考马斯染色凝胶的数字图像并进行光密度测定分析。此时，可以基于具有最大 ChAcNLS 分子数且不包含显著聚集体种类的 AC 来选择主要候选药物。

2. 用于细胞内积累评估的共聚焦显微镜

注:在开发具有目标有效载荷的制剂之前，测试肽修饰的 mAb 细胞内积累的细胞选择性非常重要。由于 Tat 也被证明具有非特异性细胞渗透的倾向，因此在进行昂贵的开发步骤和昂贵的有效载荷之前，值得首先分析细胞内积累和细胞选择性。因此，程序 1 还应修改同种型特异性不相关的对照 mAb。对于实验步骤的其余部分，我们将使用每个抗体用 10 个 ChAcNLS 分子修饰的 AC。图 1 描述了包括程序 2 和 3 的关键步骤的示意图。

注意:该方案的这一步涉及多聚甲醛的处理和作。处理时请遵循制造商的说明。

1. 用 200 nM 的 7G3-ChAcNLS 处理靶 TF-1a 细胞，包括修饰的对照 mAb。将 5 x 10⁶ 抗原阳性细胞与偶联物在 37 °C 下孵育 1 小时。
2. 1 小时后，去除上清液，用 1 mL 3x 在冰冷的 PBS 中洗涤。加入新鲜培养基，并在 37 °C 下再孵育一小时。
3. 额外一小时后，去除上清液并在 1 mL 冰冷的 PBS 中洗涤 3 次。在 37 °C 下加入 0.5 mL 含有 0.25% 胰蛋白酶和乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 PBS，持续 3 至 30 分钟。
   注意:在初始试点测试期间，建议不要用胰蛋白酶消化细胞来确定 AC 细胞内积累的差异。该方案促进了胰蛋白酶的使用，我们展示了这如何提高对不同 AC 候选者的细胞内积累效率的评估。
   1. 通过目视检查所有细胞是否分离来测试不同的孵育时间。此外，将细胞等分试样与活力染色溶液一起孵育，并如前所述进行流式细胞术分析。
   2. 用 1.5 mL 细胞培养物 RPMI 1640 培养基/10% 胎牛血清中和胰蛋白酶。以 500 x g 离心细胞 5 分钟，去除上清液，然后在 0.5 mL 冰冷的 PBS 中洗涤 3 次。
4. 将细胞固定在含有 1% 多聚甲醛和 1% 蔗糖的 0.5 mL PBS 中冰上 30 分钟。在 0.5 mL 冰冷的 PBS 中洗涤细胞 3 次，并以 250 x g 离心 5 分钟。在含有 0.15% Triton X-100 的 0.5 mL PBS 中透化细胞，在冰上透化 5 分钟。在冰冷的 PBS 中洗涤细胞并重复离心。
5. 将细胞悬浮在含有 2 μg/mL（或制造商推荐浓度）与 AlexaFluor 647 偶联的抗鼠（同种型特异性）Fc 二抗多克隆抗体的 0.1 mL PBS 中，在室温下避光放置 1 小时。
   1. 以 250 x g 离心 5 分钟，然后在 0.5 mL 冰冷的 PBS 中洗涤细胞 3 次。将细胞悬浮在 0.5 mL PBS 中。
      暂停:细胞可以储存在冰箱中。
      注意:必须选择能够识别目标 mAb 的正确同种型的二抗。选择 AF647 是因为其远红外发射不会干扰细胞核的碘化丙啶 （PI） 染色。
6. 将 PI 添加至浓度为 10 μg/mL 的容器中，加入装有细胞的容器中。接下来，使用封固剂将 1 x 10⁵ 个细胞封固在载玻片上，并用玻璃盖玻片盖住。
7. 在倒置激光扫描共聚焦显微镜上使用 Plan Apo 60X 油浸物镜 NA 1.42 检查细胞。使用 488 nm 氩激光器和 600 - 650 nm 光谱扫描棱镜检测 PI 荧光。对于 AF647 荧光，使用 633 nm 氦氖激光器和 650 - 700 nm 的光谱扫描棱镜。依次收集 PI 和 AF647 的荧光发射。
   注意:在整个单元格的评估和比较中使用相同的设置。但是，与非胰蛋白酶消化细胞相比，您必须调整胰蛋白酶消化细胞的设置。
8. 使用显微镜软件获取图像。使用 1,024 x 1,024 像素的连续水平光学切片收集图像，并在整个单元厚度上以 0.5 μm 的间隔拍摄 2X 线平均。以最大荧光强度将图像呈现为来自四个连续切片的堆叠 z 投影。
9. 使用显微镜软件分析细胞。记录偶联物的细胞分布模式。具体来说，评估细胞质中的细胞内荧光是成组的并靠近细胞表面，还是弥散且均匀的。还要评估每个细胞的相对荧光强度。

结果

图 1:AC 细胞处理方法和后续处理示意图，用于通过共聚焦显微镜进行分析和细胞分级分离质量分析。 红色箭头对应于基本步骤 2.2 和 2.3。

材料