评估病毒衍生肽修饰抗体偶联物的细胞内分布

摘要

来源：Beaudoin, S. 等，基于病毒衍生肽修饰的抗体偶联物在增强细胞摄取与改善肿瘤靶向性方面的初步评价。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用共聚焦显微镜评估病毒来源的肽段修饰抗体偶联物在细胞内分布的过程。病毒来源的核定位序列可引导抗体偶联物进入细胞质，该过程通过免疫染色和荧光检测得以证实。

方案

1. 抗体-多肽偶联

注意：胆酸连接核定位信号（ChAcNLS）可在任何商业多肽合成公司或大学附属的多肽合成服务平台进行合成。

1. 在1.7 mL微量离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.6）配制浓度为10 mg/mL（总抗体约1 mg）的7G3溶液。
2. 将磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（sulfo-SMCC）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成5–10 mM的溶液。为确保完全溶解，建议充分涡旋混匀。
3. 向含有7G3的离心管中加入已溶解的sulfo-SMCC溶液（通常为5–20 μL，具体体积取决于所需的sulfo-SMCC与7G3的摩尔比）。建议测试sulfo-SMCC与7G3的摩尔比分别为10:1、25:1和50:1的条件。室温孵育1小时。
4. 使用超滤装置对马来酰亚胺修饰的7G3进行纯化和浓缩，并在PBS（pH 7.0）中进行缓冲液置换。以8,000 × g离心约5分钟。弃去滤过液，重新加入PBS（pH 7.0），再次离心。
   1. 重复上述操作7–8次，以彻底完成缓冲液置换。将滤膜装置倒置放入洁净的微量离心管中，以1,000 × g离心2分钟，回收浓缩后的7G3蛋白。回收体积约为0.3 mL。
5. 在含有马来酰亚胺活化7G3的离心管中，加入相对于前一步所用sulfo-SMCC与7G3摩尔比两倍摩尔过量的ChAcNLS，并在4 °C下孵育过夜。例如，若前一步使用了10:1的sulfo-SMCC与7G3摩尔比，则应使用20:1的ChAcNLS与7G3摩尔比。总体积不应发生显著变化。
   注意：尽管ChAcNLS在偶联过程中不会引起沉淀，但其他肽段可能存在此类风险。反应过程中应观察离心管内是否有沉淀产生，沉淀最可能由疏水性肽段引起。在此类情况下，可重新评估目标肽段，考虑设计改造以提高其亲水性。
6. 使用超滤装置将7G3-ChAcNLS浓缩至所需浓度，并在PBS（pH 7.4）中进行缓冲液置换（参见步骤1.4）。总蛋白的回收率应不低于原始起始材料的75%。
7. 采用12%聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以评估构建的7G3-ChAcNLS候选产物（该凝胶可有效分离ChAcNLS偶联的重链与轻链与未偶联链）。取10 μg 7G3-ChAcNLS与含2 μL β-巯基乙醇的上样缓冲液混合后上样。
8. 设定适当电压（12%凝胶建议120 V，运行1小时），开始电泳。当考马斯亮蓝染料前沿迁移至凝胶底部时停止电泳。
   注意：切勿使考马斯亮蓝染料前沿跑出凝胶。
9. 从电泳装置中取出凝胶，用含10%（v/v）冰乙酸和20%（v/v）甲醇的脱色液冲洗。
10. 拍摄凝胶图像，使用尺子测量标准蛋白及7G3偶联物的迁移距离（cm），计算相对迁移率（Rf值），即迁移距离除以凝胶长度（从上样位置至考马斯亮蓝染料前沿）。以各标准蛋白的分子量（log值）对Rf值作图，并外推估算7G3偶联物的分子大小。
11. 通过将7G3偶联物与未修饰7G3之间的分子量差除以1768.5 g/mol（ChAcNLS的分子量），计算每个抗体分子偶联的肽段数量。
12. 对考马斯亮蓝染色的凝胶进行数字成像，并进行密度分析。此时可根据抗体偶联物（AC）中ChAcNLS分子数最多且无明显聚集物的条件，选择最优候选物。

2. 共聚焦显微镜用于评估细胞内累积

注意： 在开发携带特定有效载荷的制剂之前，必须测试经肽修饰的单克隆抗体（mAbs）在细胞内累积的细胞选择性。由于 Tat 也被证明具有非特异性穿透细胞的倾向，因此在投入昂贵有效载荷进行高成本研发步骤之前，首先分析其细胞内累积情况和细胞选择性尤为重要。基于此原因，程序 1 也应对同型特异性的无关对照 mAb 进行修饰。在本方案其余部分中，我们将使用每抗体分子偶联 10 个 ChAcNLS 分子的抗体偶联物（ACs）。程序 2 和程序 3 的关键步骤示意图见图 1。

注意：本实验步骤涉及对多聚甲醛的操作和处理。操作时请遵循制造商提供的说明。

1. 用200 nM的7G3-ChAcNLS（包括修饰的对照mAb）处理靶TF-1a细胞。将5 × 10⁶个抗原阳性细胞与偶联物在37 °C下孵育1小时。
2. 1小时后，弃去上清液，用1 mL预冷的PBS洗涤3次。加入新鲜培养基，并在37 °C下继续孵育1小时。
3. 额外孵育1小时后，弃去上清液，用1 mL预冷的PBS洗涤3次。加入0.5 mL含有0.25%胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS，于37 °C孵育3至30分钟。
   注意：在初始预实验中，建议不进行胰蛋白酶消化，以确定不同AC在细胞内积累的差异。本方案推荐使用胰蛋白酶，并展示其如何改善对不同AC候选分子细胞内积累效率的评估。
   1. 通过显微观察细胞是否完全脱落，测试不同的孵育时间。此外，将细胞等分试样与活率染色液孵育，并按前述方法进行流式细胞术分析。
   2. 用1.5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基中和胰蛋白酶。在500 × g下离心5分钟，弃去上清液，并用0.5 mL预冷的PBS洗涤3次。
4. 将细胞悬浮于含1%多聚甲醛和1%蔗糖的0.5 mL PBS中，冰上固定30分钟。用0.5 mL预冷的PBS洗涤细胞3次，在250 × g下离心5分钟。用含0.15% Triton X-100的0.5 mL PBS在冰上透化5分钟。用预冷的PBS洗涤细胞，并重复离心步骤。
5. 将细胞悬浮于0.1 mL PBS中，加入终浓度为2 μg/mL（或按制造商推荐浓度）的AlexaFluor 647标记的抗小鼠（同型特异性）Fc二抗，室温避光孵育1小时。
   1. 在250 × g下离心5分钟，用0.5 mL预冷的PBS洗涤细胞3次，最后将细胞重悬于0.5 mL PBS中。
      暂停：细胞可储存于冰箱中。
      注意：必须选择能够识别目标mAb正确同型的二抗。选择AF647是因为其远红外发射光谱，不会干扰细胞核的碘化丙啶（PI）染色。
6. 向细胞悬液中加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为10 μg/mL。随后，使用封片剂将1 × 10⁶个细胞滴加至载玻片上，并加盖盖玻片。
7. 在倒置激光共聚焦显微镜上，使用NA 1.42的Plan Apo 60X油镜观察细胞。使用488 nm氩激光激发PI荧光，光谱扫描棱镜设置为600–650 nm检测范围；AF647荧光则使用633 nm氦氖激光激发，光谱扫描棱镜设置为650–700 nm检测范围。依次采集PI和AF647的荧光发射信号。
   注意：在整个细胞评估与比较过程中应保持相同的仪器设置。但需根据胰蛋白酶处理组与未处理组细胞的差异调整参数。
8. 使用显微镜软件采集图像。以0.5 μm为间隔，对整个细胞厚度进行连续水平光学切片，采集1,024 × 1,024像素、2倍行平均的图像。以最大荧光强度投影方式，呈现连续四个切片叠加的z轴投影图像。
9. 使用显微镜软件分析细胞。记录偶联物的细胞内分布模式。具体评估细胞质中的荧光是否呈聚集状且靠近细胞表面，或呈弥散均匀分布。同时评估单个细胞的相对荧光强度。

结果

图1：AC细胞处理方法及其后续分析的示意图，用于共聚焦显微镜观察及细胞分馏质量分析。 红色箭头对应关键步骤2.2和2.3。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	可选择的同双功能和异双功能马来酰亚胺交联剂有多种。
Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器	EMD Millipore	UFC505096	包装规格有 8、24 和 96 个，可根据需要选择。
Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准品	BioRad	1610375EDU	分子量范围为 10–250 kDa 的多色重组蛋白。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Scientific	25200056	可选 100 mL 或 500 mL 规格。
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647 标记	Thermo Scientific	A-21235	推荐使用浓度为 1–10 μg/mL
NuPAGE LDS 样品缓冲液（4×）	Thermo Scientific	NP0007
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a 细胞	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 培养基	ATCC	ATCC 30-2001
FluoView FV1000 共聚焦显微镜	Olympus
Fluoview 软件	Olympus		www.olympus-lifescience.com