将 Aβ 肽特异性抗体和 Aβ 寡聚体可控灌注至大鼠海马区

摘要

来源：Sajadi, A.，等。通过渗透泵输注抗体治疗可抵消慢性β-淀粉样蛋白寡聚体输注动物模型中的神经退行性变。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了一种将淀粉样蛋白β（Aβ）肽特异性抗体持续灌注至大鼠海马区的技术。该研究采用植入双侧套管系统，以实现对Aβ肽特异性抗体的可控灌注，同时向大鼠海马区灌注可溶性Aβ寡聚体（Aβo），用于研究寡聚体与抗体之间的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 立体定位手术前的导管准备

1. 剪取将用于连接套管与渗透压泵的PE50导管（长度为6 cm）（见图1）。用人工脑脊液（aCSF）填充PE50导管，并封闭导管两端。将导管置于4 °C保存，直至使用。

2. 通过立体定位进行套管植入

1. 在无菌条件下进行手术。通过高压灭菌法对所有手术器械和材料进行灭菌。彻底清洁立体定位仪及操作区域，并用70%乙醇溶液消毒。佩戴外科口罩、头帽和无菌手套。
2. 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮和赛拉嗪混合溶液（剂量分别为100 mg/kg和10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。通过轻捏脚趾检查动物是否无反应，以确认麻醉效果。
3. 术前至少30分钟，对已麻醉动物皮下注射（s.c.）非甾体类抗炎药（美洛昔康；1 mg/kg）。
4. 使用电动剃毛器剃除动物头部毛发，并用2%葡萄糖酸氯己定与2%异丙醇混合溶液对皮肤进行三次消毒。在动物眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
5. 将动物固定于立体定位仪上，耳杆插入耳道。将一根导管固定在立体定位仪的持针器臂上。在动物头顶部位皮下注射局部麻醉剂（布比卡因（1.5 mg/kg）和利多卡因（1.5 mg/kg））。整个手术过程中通过鼻罩持续给予3%异氟烷以维持麻醉状态。手术区域应使用无菌布单覆盖，但本演示中未覆盖以更清晰展示操作技术。
6. 使用手术刀在动物头顶做一条长约3 cm的切口。在切口周围安装4个组织钳，以充分暴露颅骨。使用圆头剪刀在动物肩胛骨之间的皮下组织剪出一个大小为2 × 2 cm²的皮下囊袋。
7. 用刀片刮除颅骨表面的骨膜。若颅骨出血，可用纱布按压止血。
8. 确认颅骨在立体定位仪上保持水平且对位良好。为确保颅骨水平，需测量前囟（bregma）和后囟（lambda）处的高度坐标，并记录前囟坐标作为后续操作的参考点。
9. 以前囟为起点，计算将双侧植入海马区的两根导向套管的定位坐标（前后向：-0.42 cm；内外向：±0.30 cm；背腹向：-0.28 cm，参照Paxinos和Watson大鼠脑图谱）。用记号笔标记套管植入位置。
10. 在两侧套管植入点处用钻头在颅骨上钻出直径0.5 mm的孔。在上述两点上下约5 mm处再钻两个孔，用于植入固定螺钉，以便后续使用牙科水泥加固套管。
11. 用手术刀剪断预先充满aCSF的导管一端，并将其插入套管的侧臂中。使用牙科水泥固定第一根套管。注意避免在第二根套管的预定位置周围涂抹牙科水泥。
12. 等待牙科水泥干燥2–3分钟，随后将持针器臂从第一根套管上取下，并将第二根套管固定于该臂上。重复步骤2.11和2.12的操作。在两根导向套管上均插入假插管。确保假插管与导向套管长度一致，以防止组织侵入或堵塞导管。
13. 将两根导管的游离端插入先前在动物肩胛骨之间制作的皮下囊袋中。取下组织钳，使用4-0缝合线缝合皮肤。
    注意：上方的导向套管必须保持可接触状态，以便后续进行Aβo灌注。
14. 将动物从立体定位仪上取下并放回饲养笼中。术后恢复期间，将笼子置于加热水毯上，直至动物苏醒。笼子应部分置于加热垫上，以便大鼠在需要时可自行脱离热源。需持续监测动物，直至其恢复足够意识，能够维持胸卧位。
15. 术后将大鼠送回动物房，在密切观察下恢复10天。
    注意：动物未完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。术后每天给予美洛昔康（1 mg/kg）一次，连续两天，以缓解疼痛。

3. 渗透泵安装

1. 在植入前一日，按照生产商说明书，在无菌条件下将6E10抗体（1 mg/ml；100 µl）和对照IgG1抗体（1 mg/ml；100 µl）注入渗透压泵中。将泵置于无菌蒸馏水中，37 °C下过夜孵育以激活泵体。
2. 使用3%异氟烷麻醉大鼠，以植入渗透压泵（0.5 µl/hr，持续7天）。剃除肩胛骨之间的毛发，并用2%葡萄糖酸氯己定与2%异丙醇混合溶液消毒皮肤。使用手术刀在肩胛骨之间做一长约2 cm的切口，以定位与引导套管相连的PE50导管。
3. 用手术刀切断带有牙科水泥的PE50导管末端。将渗透压泵与PE50导管连接，并在泵与导管连接处添加少量牙科水泥以固定连接。
4. 使用4-0缝合线紧密缝合皮肤。将动物放回笼中，并置于加热水垫上。观察动物从异氟烷麻醉中迅速苏醒（约5分钟）。
   注意：手术过程约需5至10分钟。

4. 在清醒且自由活动的大鼠中进行 Aβo 注射

1. 制备 Aβo 溶液（0.2 µg/µl）。在室温下使 Aβo 动态且自发聚集 1 小时，然后进行灌注。
2. 在输注泵上安装两个 10 µl 注射器。用无菌蒸馏水填充注射器，每支注射器加入 5 µl。使用手术刀将两根 PE50 导管切成约 60 cm 长。使用 1 ml 注射器和 21G 针头，将无菌蒸馏水充满两根导管。
3. 将 1 ml 注射器保留在导管一端，并将另一端连接至 Hamilton 注射器。取下 1 ml 注射器，检查导管内无气泡存在。
4. 将内插管插入 PE50 导管末端。使用无菌蒸馏水，通过 Hamilton 注射器将连接到 PE50 导管的内插管填充至 1 µl 刻度。通过将活塞回拉至 2 µl 处形成一个气泡。
5. 使用低吸附枪头反复吹打混合 Aβo 溶液。混合过程中避免产生气泡。通过将活塞回拉至 3.5 µl 处，用 1.5 µl Aβo 溶液填充两根内插管。
6. 在两根导管的气泡前后用记号笔标记刻度线。此作为灌注过程中的监测点。进行灌注时，将鼠笼移近输注泵并打开笼盖。
7. 将大鼠放入束缚装置中，紧紧拉住束缚装置的臂部环绕其颈部，以固定大鼠头部。从两个导向插管中取出假插管。将先前准备好的内插管插入导向插管中。确认其已完全插入并牢固固定于导向插管基部。
8. 松开束缚装置，将大鼠放回笼中以减少应激反应。密切观察，确保导管未相互缠绕且灌注过程正确进行。
9. 开启输注泵。以 0.1 µl/min 的速度注入 1 µl Aβo 溶液（持续 10 分钟）。灌注过程中，检查注射器活塞是否从 3.5 µl 移动至 2.5 µl，并确认两根 PE50 导管中的气泡持续移动。
10. 灌注结束后，保持内插管原位静置 5 分钟，以促进 Aβo 溶液的有效扩散。将大鼠重新放入束缚装置中，取出内插管并盖上导向插管帽，防止注入溶液反流。使用刚好到达插管弯臂前的假插管。将动物放回笼中。
11. 连续 6 天每天重复一次 Aβo 灌注。通过断头法处死动物。

结果

图1. Aβo灌注期间双侧套管植入大鼠的动物照片。 使用连接至插入导向套管的内套管的PE50导管，将Aβo溶液（0.2 µg/µl；1 µl）每日一次、连续6天注入清醒且自由活动的大鼠体内。对照（Ctl）IgG1或6E10抗体通过置于动物肩胛骨之间皮下的渗透泵直接输注至Aβo灌注部位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液 (aCSF)	Harvard Apparatus	59-7316
PE50 导管薄壁	Plastics one	C232CT
盐酸氯胺酮 (100 mg/mL)	Bioniche	1989529
盐酸赛拉嗪 (100 mg/mL)	Bimeda	8XYL004C
美洛昔康 (5 mg/mL)	Norbrook	215670I01
2% 葡萄糖酸氯己定与 2% 异丙醇溶液	Carefusion	260100C
盐酸利多卡因	Alveda Pharma	0122AG01
盐酸布比卡因	Hospira	1559
眼科软膏	Bausch and Lomb inc.	2125706
立体定位仪框架	Stoelting	51600
立体定位套管固定臂	Harvard Apparatus	72-4837
钻机	Dremel	8050-N/18
引导套管	Plastics one	326OPG/spc
注射套管	Plastics one	C315I/spc
假性套管	Plastics one	C315DC/spc
涂层薇乔快线 4-0 缝合线	Ethicon	VR2297
牙科丙烯酸水泥	Harvard Apparatus	72-6906
螺钉	JI Morris Company	P0090CE125
6E10 抗体（小鼠 IgG1 同型）	BioLegend	803003
小鼠 IgG1 同型对照抗体	Abcam	AB18447
Alzet 渗透压泵型号 1007D	Durect corporation	290
异氟烷	Baxter	CA2L9100
β-淀粉样蛋白 1-42	rPeptide	A-1163-1
哈密尔顿注射器 (10 µL)	Fisher Scientique	14815279
输注注射泵 CMA 402	Harvard Apparatus	CMA8003110
1 mL 注射器	BD	309659
21G 针头	Terumo	NN-2125R
Snuggle	Lomir Biomedical	RTS04