使用电容型免疫探针生物传感器进行靶肽的检测与测定

摘要

来源：Kluge, N. 等，利用电容式免疫探针在猪心脏中进行神经肽动态的实时活体测量 J. Vis. Exp.(2022)。

本视频展示了一种利用电容型免疫探针生物传感器检测和定量肽类递质的方法。经过功能化修饰并涂覆有抗体的电极可与目标肽相互作用，引起信号变化，从而实现对肽的精确定量与检测。

方案

1. 电容型免疫探针的制备与功能化

1. 取一段25 cm长的全氟烷氧基（PFA）涂层铂丝（见 材料表），使用手术刀从一端剥离约5 mm的PFA涂层，注意不要割伤铂丝。
2. 将剥离后的铂丝端插入镀金的1 mm公头连接针中，并使用尖嘴钳将连接针的齿状部分压接在铂丝裸露端上（见 材料表）。
3. 将铂丝焊接到镀金连接针上，注意不要使用过多焊料。
4. 通过搅拌将50 mg多巴胺盐酸盐溶解于50 mL 10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0）中，配制多巴胺溶液。
5. 待多巴胺完全溶解后，将铂丝末端浸入盛有新配制的含多巴胺PBS溶液的容器中。将一个金质连接针插入前置放大器的一个通道内（见 材料表）。
6. 将氯化银（AgCl）圆盘电极（接地电极，见 材料表）连接至前置放大器的接地通道，并将AgCl圆盘放入含有含多巴胺PBS溶液和铂丝的容器中；注意仅使圆盘电极浸没，避免导线或焊点接触液体。在继续下一步前，将一根导线分流器接入前置放大器的参考通道。
7. 打开交互式数据采集软件（见 材料表）。设置一个锯齿波电沉积电位程序，参数如下：起始电位 = −0.6 V；终止电位 = +0.65 V；扫描速率 = 0.04 V∙s^-1；沉积持续时间 = 420 s。启动聚多巴胺沉积程序，并确保所有导线连接正确。
8. 完成聚多巴胺沉积后，小心地将AgCl接地片和铂丝末端从容器中取出，注意不要扰动铂丝电极的尖端。将铂丝尖端放入盛有PBS（pH 7.4）的微量离心管中浸泡2–5分钟，同时准备抗体溶液；确保铂丝尖端不接触离心管壁或底部。
   注意：抗体溶液可在聚多巴胺沉积过程中配制；但聚多巴胺沉积完成后，必须将铂丝从含多巴胺的容器转移至PBS离心管中，此步骤不可省略。
9. 配制抗体溶液。将目标抗体与PBS（pH 7.4）按1:20的比例在适当大小的容器（如微量离心管）中混合。
   注意：本实验所用抗神经肽Y（anti-NPY）单克隆抗体（见 材料表）原液浓度为1 mg/mL；示例配比为4 µL抗体加入76 µL PBS中。
10. 将沉积了聚多巴胺的铂电极尖端浸入抗体溶液中，在室温下孵育至少2小时，再次确保铂丝尖端悬浮于溶液中，不接触微量离心管内壁。
    注意：近期该技术的实施更倾向于在此步骤后立即使用铂丝电极，而非湿态或干态保存以供后续使用。
11. 在抗体溶液中孵育后，用PBS（pH 7.4）短暂冲洗新功能化的电容型免疫探针（CI探针）尖端。探针现已准备就绪，可供使用。

2. 实验设置用于 体外 肽的检测与定量

1. 将CI探针的功能端插入流室中，注意不要以任何方式触碰或扰动电极尖端，以免损坏探针的感应端。
   注意：流室是通过将硅橡胶（见 材料表）倒入一个直径为35 mm的培养皿中制成，培养皿中央放置一个细长的椭圆形占位器。待硅橡胶固化后，取出椭圆形占位器即形成流室。实验时用Tris缓冲盐水（TBS）持续灌流流室，流速维持在3 mL/min。应确保进液和出液保持流室内液面稳定，避免灌流液出现潮汐样波动。只要CI探针处于使用状态，灌流必须持续进行。
2. 在首次实验测试前，使用TBS进行标准运行以预处理CI探针。设置如下命令电压程序：正向阶跃电位 = +100 mV；负向阶跃电位 = −5 mV；阶跃持续时间 = 20 ms；数据采集时长 = 600 s。
   注意：在数据采集前的初始循环阶段，必须给予探针足够的平衡时间，以确保其稳定。
3. 使用相同的TBS配制目标肽溶液，以维持灌流液的组成一致。建立一个分流系统，使灌流液可在TBS与添加肽的TBS之间切换，同时避免向管路系统或流室中引入气泡。
   注意：本研究中使用了合成的猪源性NPY肽（见 材料表）。
4. 采用TBS标准参数设置肽检测的数据采集程序（参见步骤2.2）。
   ​注意：在本实验中，每次测试的总时长为360 s（前120 s为TBS灌流，中间120 s为添加肽的TBS灌流，最后120 s再次恢复为TBS灌流）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AgCl圆盘电极	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
抗NPY单克隆抗体	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
定制多通道放大器/1 MΩ反馈电阻多通道前置放大器	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	基于NPI VA-10M多通道放大器
盐酸多巴胺	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
镀金公头连接针	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 模数/数模转换设备	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro 数据采集软件，v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		控制电位指令和数据采集的软件为自行编写
Masterflex L/S 标准数字蠕动泵	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA涂层铂丝	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	裸直径0.005"，涂层直径0.008"
硅酮弹性体	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
合成猪源NPY肽	Bachem (Torrance, CA)	4011654