使用电容式免疫探针生物传感器进行靶肽检测和测量

摘要

来源:Kluge， N. et al.， 通过电容免疫探针对猪心脏神经肽动力学进行时间分辨体内测量。J. Vis. Exp.（2022 年）。

该视频演示了一种使用电容式免疫探针生物传感器检测和定量肽递质的方法。包被抗体的功能化电极与目标肽相互作用，导致信号变化，从而可以精确测量和检测肽。

方案

1. 电容免疫探针的制备和功能化

1. 剪下 25 厘米长的全氟烷氧基 （PFA） 涂层铂丝（参见材料表），并使用手术刀从一端剥去约 5 毫米的 PFA 涂层，注意不要切入铂丝。
2. 将铂丝的剥皮端插入镀金 1 mm 公连接器针中，并使用尖嘴钳将连接器针齿压接在铂丝剥皮端周围（参见材料表）。
3. 将铂线焊接到镀金连接器引脚。小心不要使用过多的焊料。
4. 通过搅拌将 50 mg 盐酸多巴胺溶解在 50 mL 10 mM 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 6.0）中来制备多巴胺溶液。
5. 多巴胺完全溶解后，将铂丝的尖端放入装有新鲜制备的补充多巴胺的 PBS 的容器中。将金连接器针插入 Headstage 的通道（参见材料表）。
6. 将氯化银 （AgCl） 圆盘电极（接地电极，参见材料表）连接到头部的接地通道。将 AgCl 圆盘放入含有补充多巴胺的 PBS 和铂丝的容器中;小心只将圆盘电极浸入水中，不要浸入任何长度的电线或焊料中。在继续之前，将分线器连接到头部的参考通道。
7. 打开交互式数据采集软件（参见材料表）。准备具有以下参数的锯齿电沉积指令电位协议:起始电位 = −0.6 V;端电位 = +0.65 V;扫描速率 = 0.04 V∙^s-1;沉积持续时间 = 420 秒。开始聚多巴胺沉积协议，确保所有电线都连接正确。
8. 完成聚多巴胺沉积后，从容器中取出 AgCl 研磨颗粒和铂丝尖端，注意不要干扰铂丝电极的尖端。在制备抗体溶液时，将导线尖端放入含有 PBS （pH 7.4） 的微管中 2-5 分钟;确保线尖不接触微管的侧面或底部。
   注:抗体溶液可在聚多巴胺沉积过程中制备;然而，在聚多巴胺沉积后，不应跳过铂丝从含多巴胺的容器转移到 PBS 的微管。
9. 制备抗体溶液。将目标抗体与 PBS （pH 7.4） 以 1:20 的比例混合在适当大小的容器（例如微管）中><。 注:此处使用的抗神经肽 Y（抗 NPY）单克隆抗体（参见材料表）的等分浓度为 1 mg/mL;此处的示例抗体制备是 4 μL 抗体与 76 μL PBS 的抗体。
10. 在室温下将铂电极的聚多巴胺沉积尖端浸泡在抗体溶液中至少 2 小时，再次确保铂丝尖端悬浮在溶液中，而不是停留在微管的内表面。
    注意:该技术的最新实施有利于在此步骤后立即使用铂丝电极，而不是湿式或干式储存以备后用。
11. 浸泡在抗体溶液中后，在 PBS （pH 7.4） 中短暂冲洗新功能化的电容免疫探针（CI 探针）尖端。探头现在可以使用了。

2. 多肽体外检测和测量的实验装置

1. 将 CI 探头的功能尖端放入流通室中，注意不要以任何方式干扰电极尖端，因为这样做可能会损坏探头的传感尖端。
   注:通过将硅弹性体（参见材料表）倒入 35 mm 培养皿中，并在培养皿中心放置细长的卵形空间填充物来形成流动室。硬化后，从弹性体中去除卵形。然后用 Tris 缓冲盐水 （TBS） 对腔室进行超级熔注，并允许 3 mL/min 的流速。确保流入和流出保持腔室中的液位，这样就不会观察到超级熔岩的潮汐作用。只要使用 CI 探针，流就必须保持原位。
2. 在第一次实验测试之前，执行 TBS 标准运行以调节 CI 探针。设置以下命令音量tage 协议:正步进电位 = +100 mV;负阶跃电位 = −5 mV;步长 = 20 毫秒;采集持续时间 = 600 秒
   注意:在数据采集之前，在循环命令电位的初始阶段允许探针的平衡非常重要。
3. 使用相同的 TBS 制备目标肽的溶液，以保持超级熔渣的组成。设置一个歧管系统，其中超级熔渣可以在 TBS 和补充肽的 TBS 之间切换，而不会将气泡引入管道系统或流通室。
   注:本研究中使用了合成猪 NPY 肽（见材料表）。
4. 使用 TBS 标准参数设置肽传感数据采集方案（参见步骤 2.2）。
   注意:在此实施中，每个实验测试的持续时间为 360 秒（120 秒 TBS，120 秒肽补充 TBS，120 秒 TBS）。

材料