一种用于研究海马神经元中谷氨酸受体转运的体外技术

摘要

来源：Chiu, A. M.，等。一种用于研究离解原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的抗体示踪方法。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种通过抗体喂养的方法来研究原代海马神经元培养中谷氨酸受体的转运过程。该方法可同时观察细胞质膜和内膜系统上的受体群体。通过在细胞膜透化前后分别进行标记，使用相同的初级抗体但结合不同荧光染料的次级抗体，从而实现对这两类受体亚群的区分。

方案

1. 标记前的准备

1. 原代海马神经元培养物的制备与维持​
   1. 将原代海马神经元以每18 mm盖玻片接种150,000个细胞的密度，接种于经多聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）包被的盖玻片上。有关解离神经元培养制备的优秀指南已有广泛资源。
      注意：如有需要，可在体外培养第1天（DIV1）起使用阿糖胞苷（Ara-C，10 μM）处理培养物，以避免胶质细胞增殖。
      注意：可使用其他替代包被试剂，如纤连蛋白（1 mg/mL）或层粘连蛋白（5 μg/mL），代替多聚-D-赖氨酸。
   2. 将培养物置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下，使用含B27和2 mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基（每孔2 mL）进行维持培养。
      注意：如有需要，可使用L-谷氨酰胺的替代物（如Glutamax）。
   3. 每周更换一半体积的培养基，并补充等体积的含添加剂的Neurobasal培养基。
2. 可选：突变型和/或表位标签受体的转染
   注意：为确保受体充分表达，神经元应在分析时间点前至少3–4天进行转染。使用较年轻的神经元（DIV6–9）比使用较老的神经元（DIV15–20）具有更高的转染效率，但无论使用何种DIV，均可获得足够数量的转染细胞（>20）。
   1. 对于12孔板中的每一孔，取1.5 μg含有目标构建物的质粒DNA，溶于100 μL不含B27和谷氨酰胺的新鲜Neurobasal培养基中，置于微量离心管内，并通过快速涡旋混匀。
      注意：为实现成功转染，所用Neurobasal培养基应尽可能新鲜，理想情况下为开瓶后一周内。
   2. 在另一微量离心管中，将1 μL适当的脂质体转染试剂加入100 μL新鲜Neurobasal培养基中，轻轻混匀。
      注意：切勿涡旋脂质体转染试剂混合物。使用新鲜的脂质体转染试剂可提高转染效率。
   3. 室温（RT）孵育5分钟。
   4. 将脂质体转染试剂混合物逐滴加入DNA混合物中，轻轻混匀后，室温孵育20分钟。
   5. 将每孔中的培养基体积调整为1 mL的条件培养基。
   6. 将脂质体转染试剂-DNA复合物逐滴加入孔中。
   7. 将细胞放回培养箱，至少孵育3–4天以进行蛋白表达。
      注意：针对下文所述的内吞与再循环实验方案，海马神经元在DIV11–12时转染表达在胞外域带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的GluN2B（GFP-GluN2B）构建物，并于DIV15–16时进行成像。
3. 可选：在固定前，于条件培养基中对细胞进行药物处理（慢性或急性）。
   ​注意：对于急性处理，应在标记前开始给药。根据所用药物处理方案，可在第2部分操作期间持续将细胞维持在含药物的培养基中。在本示例中，DIV21的细胞接受了化学诱导的长时程增强（cLTP）处理，以增加细胞表面表达的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（AMPAR）。
   1. 将条件培养基更换为细胞外溶液（ECS）。
   2. 在室温下，用含300 μM甘氨酸的ECS处理细胞3分钟。作为对照，用不含甘氨酸的ECS处理另一块平行的盖玻片。
   3. 用37 °C的ECS洗涤细胞3次，随后将细胞置于不含甘氨酸的ECS中，放回细胞培养箱孵育20分钟，然后继续进行第2部分操作。
      注意：ECS（单位为mM）：150 NaCl，2 CaCl₂，5 KCl，10 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），30 葡萄糖，0.001 河豚毒素（TTX），0.01 番木鳖碱，0.03 毕可毒素，pH 7.4。

2. 细胞表面表达受体的活体标记

1. 准备盖玻片用于标记​
   1. 为节约试剂并便于操作，将细胞面朝上的盖玻片转移至覆盖有石蜡膜的托盘中。
      ​注意：切勿让样品干燥。
   2. 将预孵育培养基保存并在 37 °C 条件下维持，用于孵育和洗涤步骤。
      注意：对于直径 18 mm 的盖玻片，建议抗体标记时使用 75–100 μL 培养基，内化/再循环实验时使用 120–150 μL。
2. 用一抗标记细胞表面受体​
   1. 将细胞与用预孵育培养基稀释的一抗在室温下孵育 15 分钟。
      注意：对于 GFP 标签受体，使用 1:1000 稀释倍数的兔抗 GFP 抗体；对于内源性 GluA1，使用 1:200 稀释倍数的鼠抗 GluA1 抗体。
   2. 使用真空移液器小心吸除含抗体的培养基，并用预孵育培养基洗涤细胞三次。
      注意：若无预孵育培养基，所有洗涤步骤均可使用 PBS+ [含 1 mM MgCl₂ 和 0.1 mM CaCl₂ 的磷酸盐缓冲液 (PBS)] 进行。如无温和真空抽吸设备，可使用移液器手动吸除。

3. 表面表达 (图1)

1. 细胞表面表达受体的二抗标记
   1. 用 PBS+ 洗涤一次。
   2. 将细胞在含 4% 多聚甲醛（PFA）和 4% 蔗糖的 PBS 中孵育 7–8 分钟以固定细胞。
      注意：与其他固定方法（如甲醇孵育）不同，PFA 不会穿透细胞膜，因此适用于细胞表面表达分析。为获得最佳效果，应使用新鲜配制的 PFA。短期储存可在 4 °C，或长期（最长 30 天）储存于 -20 °C，均可保证足够的固定效果。
      警告：PFA 是已知的致癌物。操作时需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
   3. 用普通 PBS 洗涤细胞三次。
      注意：也可使用 0.1 M 甘氨酸代替 PBS 洗涤 PFA，因为甘氨酸可淬灭任何残留的固定剂，从而降低样本背景信号。
   4. 在 PBS 中加入 10% 正常山羊血清（NGS）于室温孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。
      注意：延长封闭时间不会对标记产生不利影响。
   5. 将荧光标记的二抗用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，于室温孵育 1 小时，以标记已结合一抗的受体（即细胞表面表达的受体）。
      注意：在这些示例中，使用了 1:500 稀释度的 Alexa 555 标记二抗：针对 GFP 标记受体使用山羊抗兔抗体，针对 GluA1 使用山羊抗小鼠抗体。
   6. 用 PBS 洗涤细胞三次。
2. 细胞内受体的标记
   1. 在室温下用含 0.25% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 5–10 分钟以通透细胞膜。
      注意：为验证第一轮抗体标记已占据所有细胞表面表位，可在平行培养的样本中省略此通透步骤。在此情况下，不应检测到细胞内受体信号。此外，为验证在前一节（第 2 节）中未发生细胞内受体的标记（即证明培养中细胞膜的完整性），也可在平行样本中省略通透步骤，并在步骤 2.2.1 中使用针对细胞内蛋白的一抗（例如突触后密度蛋白 95 [PSD-95] 或微管相关蛋白 2 [MAP2]）。在此条件下，该一抗不应产生任何信号。本示例中使用了 1:500 稀释的兔抗 PSD-95 抗体。
   2. 在 PBS 中加入 10% NGS，室温封闭 30 分钟。
   3. 将已通透的细胞与第 2.2 节中使用的相同一抗，用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，于室温孵育 1 小时，以标记细胞内受体。
      注意：标记细胞内受体所需的一抗稀释度可能与标记细胞表面受体时不同。以 GluA1 为例，本实验中使用了相同的抗体稀释度（1:200）。
   4. 用 PBS 洗涤细胞三次。
   5. 将第二种荧光标记的二抗用含 3% NGS 的 PBS 稀释后，于室温孵育 1 小时进行标记。
      注意：在这些示例中，使用了 1:500 稀释的山羊抗小鼠 Alexa 647 标记二抗（用于 GluA1）。
   6. 用 PBS 洗涤细胞三次。

4. 内化作用 (图2)

1. 抗体标记的膜表面受体内化​
   1. 完成膜表面表达受体的标记并洗去抗体后（见第2.2节），将细胞置于不含抗体的条件培养基中，并放回培养箱（37 °C）以启动内化过程。
      ​注意：对于N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，建议内化时间为30分钟。作为对照，可将平行培养的细胞在内化过程中置于4 °C的条件培养基中。在此低温条件下，受体内化应极少发生。
2. 膜表面受体的标记
   1. 用PBS+洗涤细胞一次。
   2. 用含4% PFA和4%蔗糖的PBS固定细胞，时间7–8分钟。
      注意：操作PFA时需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
   3. 用普通PBS洗涤细胞3次。
   4. 用含10% NGS的PBS在室温下封闭30分钟，以防止非特异性结合。
   5. 将样品与荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后孵育1小时（室温），以标记已结合一抗的受体（即未发生内化的膜表面表达受体）。
      注意：本示例中使用了Alexa 555标记的山羊抗兔二抗（1:500）进行标记。
   6. 用PBS洗涤细胞3次。
3. 内化受体的标记
   1. 用含0.25% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理，时间5–10分钟。
   2. 用含10% NGS的PBS在室温下孵育30分钟，以阻断非特异性结合。
   3. 将样品与荧光标记的二抗在含3% NGS的PBS中稀释后孵育1小时（室温），以标记已内化的抗体结合受体。
      注意：本示例中使用了Alexa 647标记的山羊抗兔二抗（1:500）进行标记。
   4. 用PBS洗涤细胞3次。

5. 回收（图3）

1. 抗体标记的膜表面受体内化​
   1. 完成膜表面表达受体的标记及抗体洗涤后（见第2.2节），将细胞置于不含抗体的条件培养基中，并放回培养箱（37 °C）孵育，以允许受体内化。
      ​注意：对于NMDA受体，建议内化时间为30分钟。
2. 封闭稳定表达于细胞表面的受体
   1. 为了封闭未内化的、结合在膜表面受体上的初级抗体的表位，使用无标记的Fab抗IgG（H+L）抗体片段（针对第2.2节中使用的初级抗体）按20 μg/mL浓度溶于条件培养基中，在室温下孵育细胞20分钟。该处理可防止后续与二抗发生结合。
      注意：本示例中使用了山羊抗兔Fab片段。
      注意：对照实验：为确认膜表面受体已完全封闭，可将平行的盖玻片分别在有或无Fab片段的条件下孵育。Fab处理后立即固定细胞，并将两组样品均与Alexa 555标记的二抗共同孵育。若在含Fab片段孵育的细胞中未检测到Alexa 555信号，则表明抗体封闭成功。
   2. 用条件培养基洗涤细胞3次。
   3. 将细胞与含有80 μM dynasore的条件培养基共同孵育，并放回培养箱（37 °C），以允许已内化的受体进行再循环。Dynasore是一种GTP酶抑制剂，可抑制dynamin功能，从而阻止进一步的内化过程。
      注意：建议NMDAR再循环时间为45分钟。需注意，Dynasore仅特异性阻断dynamin依赖性的内化过程（例如NMDAR的内化），而其他突触蛋白的内化（非dynamin依赖性）在Dynasore存在时仍可能发生。
3. 再循环受体的标记
   1. 用PBS+洗涤细胞一次。
   2. 使用含4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的PBS溶液固定细胞7–8分钟。
      注意：操作PFA时应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
   3. 用PBS洗涤细胞3次。
   4. 用含10%正常山羊血清（NGS）的PBS溶液在室温下封闭30分钟，以减少非特异性结合。
   5. 将细胞与第一种荧光标记的二抗（按1:500稀释于含3% NGS的PBS中）在室温下孵育1小时进行标记。
      注意：本示例中使用了Alexa 555标记的山羊抗兔抗体（1:500）进行标记。
   6. 用PBS洗涤细胞3次。
      注意：延长PBS洗涤时间（5–10分钟）可能有助于降低背景信号。
4. 内化受体的标记
   1. 使用含0.25% Triton X-100的PBS溶液对细胞进行透化处理，持续5–10分钟。
   2. 用含10% NGS的PBS溶液在室温下封闭30分钟。
   3. 加入第二种荧光标记的二抗（按1:500稀释于含3% NGS的PBS中），在室温下孵育1小时进行标记。
      注意：本示例中使用了Alexa 647标记的山羊抗兔抗体（1:500）进行标记。
   4. 用PBS洗涤细胞3次。

6. 样品的封片与成像

1. 将盖玻片细胞面朝下，轻轻放置在12–15 μL适当的封片剂上进行封片。
   注意：吸除多余的封片剂可提高图像质量。
2. 在合适的共聚焦显微镜上观察细胞。
   注意：建议以60倍放大倍数进行z轴层扫，步长为0.35 μm，覆盖神经元的完整厚度。

7. 时间考量

1. 这是一个较长的实验方案，可在多个步骤暂停。如有需要，可将封闭和一抗孵育步骤在4 °C湿盒中过夜进行。
2. 或者，如有需要，可使用微波组织处理仪显著缩短固定后孵育时间。所有步骤均使用150 W、30 °C的“开启”设置。​
   1. 进行封闭时，运行处理仪程序：2分钟“开启”，1分钟“关闭”，再2分钟“开启”。
   2. 进行一抗和二抗孵育步骤时，运行处理仪程序：3分钟“开启”，2分钟“关闭”，再3分钟“开启”。
      注意：我们发现对上述方案进行这些修改后，实验质量无明显差异。

8. 图像分析

1. 建议使用 FIJI <https://fiji.sc/> 进行图像分析，因为它兼容多种文件格式。对于我们的数据，图像是以尼康 ND2 文件格式获取的。
2. 提供了一个宏脚本，以便对 FIJI 预先选定的不同参数进行批量量化。该宏包含以下步骤：
   注意： 在这些示例中，测量的是“总强度”（integrated intensity）。
3. 在 FIJI 中打开图像文件并分离各通道。
4. 对每个通道的图像堆栈进行 Z 轴投影，采用最大强度投影法。
5. 为每个通道设置下限阈值。
   注意： 阈值应根据每组实验数据通过经验确定。虽然每个通道可以具有不同的下限阈值，但关键是要在同一数据集的所有图像中保持通道阈值的一致性。
6. 选择三到五段二级或三级树突，并将其保存为感兴趣区域（ROIs）。
7. 测量每个 ROI 在表面通道和细胞内通道中的积分密度（integrated density）。
8. 通过将表面通道的积分密度值除以细胞内通道的积分密度值，对每个 ROI 的信号进行归一化处理。
9. 对所有对照组和实验组图像重复上述测量，并将实验组数值相对于对照组数值进行归一化（例如 GluN2B WT 或无甘氨酸条件）。

结果

图1：cLTP增加GluA1的表面表达。 在DIV21阶段的原代海马神经元通过在含甘氨酸的ECS中孵育进行化学长时程增强（cLTP）处理。对表面表达（红色）与细胞内（蓝色）GluA1群体进行区分标记，结果显示AMPA受体表面表达显著增加。（A）单平面图像和（B）Z轴叠加（最大强度投影）共聚焦图像。比例尺 = 50 µm（全细胞）或5 µm（树突）。图表显示cLTP处理后GluA1表面表达增加。表面表达指数：表面/细胞内受体（n = 3；细胞数量：对照组 = 7；cLTP组 = 7；数值表示为均值 ± 标准误；****p < 0.0001，采用Mann-Whitney U...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 mm 直径 #1.5 厚度盖玻片	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555 标记的山羊抗小鼠二抗	Life Technologies	A21424
Alexa 555 标记的山羊抗兔二抗	Life Technologies	A21429
Alexa 647 标记的山羊抗小鼠二抗	Life Technologies	A21236
Alexa 647 标记的山羊抗兔二抗	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar 平底细胞培养板	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
葡萄糖	Sigma	G8270
甘氨酸	Tocris	219
山羊抗兔 Fab 片段	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
小鼠抗 GluA1 抗体	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm 封口膜	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
荷包牡丹碱	Tocris	1128
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7280
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36934
兔抗 GFP 抗体	Invitrogen	A11122
兔抗 PSD-95 抗体	Cell Signaling	2507
士的宁	Tocris	2785
蔗糖	Sigma	S0389
Superfrost plus 显微镜载玻片	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078