所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。
1. 靶向微球的制备
- 选择一个相关的靶抗原。
注意：在本示例中使用了重组蛋白 V1V2-2F5K，该蛋白被设计用于模拟天然 HIV 包膜的三聚体顶端结构。
- 根据制造商的说明书，使用商用试剂盒（材料表）进行生物素标记。
- 根据以下公式计算为实现5倍摩尔过量所需加入反应体系的生物素试剂的毫摩尔数：mmol 生物素 = 蛋白液体积（mL）×（蛋白质量（mg）/蛋白液体积（mL））×（生物素毫摩尔数（mmol）/蛋白质量（mg））×（5 mmol 生物素/mmol 蛋白）。然后使用以下公式计算需加入的生物素试剂体积（µL）：µL 生物素 = mmol 生物素 × (1,000,000 µL/L) × (L/10 mmol)。
- 在打开前将生物素试剂平衡至室温。根据上述计算结果，将蛋白溶解于 0.5−2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 在二甲基亚砜（DMSO）中配制 10 mM 的生物素试剂溶液，并将适当体积的 10 mM 生物素试剂加入蛋白溶液中，冰上孵育 2 小时或室温孵育 30 分钟。
- 使用蛋白浓缩装置（聚醚砜 [PES] 膜，3 kDa 分子量截留值 [MWCO]，0.5 mL；材料表）按照制造商说明去除未反应的游离生物素。
- 将样品加入离心柱的上层室，并加入 PBS 至总体积达 400 µL。盖紧盖子，然后将该样品室插入收集管中。在室温下以 12,000 × g 离心 30 分钟。
- 弃去滤过液，再加入 PBS 至 400 µL，重复离心步骤。再次弃去滤过液，加入 PBS 至 100 µL。使用分光光度计测定蛋白浓度。
注意：蛋白可分装后于 -80 °C 冻存，待后续使用。
2. 抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）检测板的制备
- 根据制造商说明，将生物素标记的蛋白质与1 µm微球（“微珠”；材料表）进行偶联。
- 每孔偶联微珠，将6 µg蛋白质与12 µL储存液中的微珠在200 µL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中室温孵育1小时，每20分钟轻轻涡旋混匀一次。
- 在13,000 x g条件下离心5分钟。弃上清液，轻轻涡旋并重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS中。重复离心和洗涤步骤两次。最后重悬于1200 µL含0.1% BSA的PBS中。
- 将10 µL微珠溶液分装至圆底96孔板的每个孔中。用12 µL含2%人血清白蛋白（HSA）的HBSS缓冲液配制待测抗体或免疫血清的系列稀释液，通常起始浓度为50 µg/mL抗体或1/100血清稀释度。
注意：在示例数据中，使用了单克隆抗体（mAb）830A。
- 向微珠板中每孔加入10 µL梯度稀释的抗体/血清，37 °C孵育2小时。每孔加入200 µL含2% HSA的HBSS缓冲液，将板在2,000 x g条件下离心10分钟。
- 迅速翻转板子并将孔中液体倾倒至水槽中，小心移除上清液，避免扰动不可见的微珠沉淀。
3. 母乳细胞的分离
- 使用双头电子或手动吸奶器，从健康的哺乳期女性获取人乳。在挤出后约 4 小时内分离细胞，并将乳汁置于室温保存。
- 使用 50 mL 离心管，将 50 mL 乳汁在 800 × g 条件下离心 15 分钟。小心倾去脱脂乳和脂肪层，避免扰动底部的细胞沉淀。用无绒擦拭布擦拭管内壁，以去除管壁上残留的所有脂肪。
- 加入 10 mL 含 2% 人血清白蛋白的汉克平衡盐溶液（2% HSA HBSS [不含 Ca2+ 或 Mg+]）。通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，以避免细胞活化和凋亡。转移至 15 mL 离心管中，在 450 × g 条件下离心 10 分钟。
- 倾去上清液，并重复步骤 1.3。然后根据预期细胞数量，用 1−2 mL 的 2% HSA HBSS 轻柔重悬细胞，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，同时记录细胞活力。
4. ADCP 检测
注意：此处描述的方法改编自 Ackerman 等人。
- 在每个ADCP测定板孔中加入50,000个新分离的骨髓（BM）细胞，体积为200 µL的2% HSA-HBSS。在37 °C下孵育2小时。
- 对于对照实验，在将细胞加入板之前，先在37 °C下与10 µg/mL的肌动蛋白抑制剂（细胞松弛素D）、50 µg/mL的Fc受体阻断剂（FcBlock）或两者联合预孵育。
- 以930 × g 离心板10分钟。加入200 µL的2% HSA HBSS并重复离心。小心移除上清液（如步骤2.7所述），并重复洗涤一次。
- 小心移除上清液，并使用每孔50 µL的2% HSA HBSS中含0.5 µg/mL（终浓度）的可固定活力染料450对细胞进行活力染色。室温避光孵育20分钟。以930 × g 离心10分钟，移除上清液（如步骤2.7所述）。加入200 µL的2% HSA HBSS，再次离心，随后移除上清液（如步骤2.7所述）。
- 完成活力染色后，对细胞进行感兴趣的白细胞标志物染色，至少应包括CD45特异性染料，例如PE-小鼠抗人CD45（克隆HI30），使用优化后的浓度（示例数据中为50 µL的1% BSA HBSS中含1 µg/µL）。
注意：可根据需要加入任何感兴趣的谱系特异性标志物。
- 室温避光孵育20分钟。以930 × g 离心10分钟，移除上清液（如步骤2.7所述）。加入200 µL的1% BSA HBSS并重复离心。移除上清液。在室温避光条件下，用200 µL的0.5%甲醛固定细胞30分钟，或在4 °C下过夜固定。固定后置于暗处冷藏，直至分析。
5. 流式细胞术分析
- 在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图上进行初步设门，以排除双联体及碎片（FSC < 5000 的物质）（见图1）。使用 SSC 与活力染料（本例中为 V450）图排除死细胞（活力染料阳性细胞）。
- 利用 SSC 与 CD45 图区分主要的白细胞类别（粒细胞、单核细胞、淋巴细胞），具体方法已有广泛描述。
注意：该分类仅为提示性，需通过谱系特异性标记物确认细胞类型。
- 针对所有 CD45+ 细胞，或感兴趣的各个白细胞亚群，通过在异硫氰酸荧光素（FITC）通道的直方图中对 bead 阳性细胞设门，以检测 ADCP 活性（bead 阳性信号在此通道中被检测）。
注意：未添加 beads 的阴性对照孔可指示直方图中 bead 阳性细胞的位置，从而确定设门标记的位置。
- 将 ADCP 评分计算为（bead 阳性细胞的中位荧光强度 [MFI]）×（bead 阳性群体中占总 CD45+ 细胞的百分比）。使用图形软件绘制每个抗体/血清浓度下的评分，并进行曲线下面积（AUC）分析。
注意：若待测样本的 ADCP 评分 AUC 超过非特异性阴性对照单抗（本例中为 3865）AUC 的 3 倍标准差，则认为 ADCP 为阳性。
