一种体外检测吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用的实验方法

摘要

来源：Powell, R. L.，等。从人乳中分离白细胞用于针对 HIV 靶标的抗体依赖性细胞吞噬作用检测。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种检测乳汁吞噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的实验方法。将荧光标记的、与抗原-抗体复合物偶联的微球与从乳汁中分离的细胞悬液混合，以诱导吞噬性白细胞发生抗体依赖性细胞吞噬作用。通过使用针对常见白细胞抗原（CD45）的抗体对细胞进行标记后，采用流式细胞术检测微球阳性且具有活力的吞噬性白细胞的荧光强度，从而反映ADCP活性水平。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 靶向微球的制备

1. 选择一个相关的靶抗原。
   注意：在本示例中使用了重组蛋白 V1V2-2F5K，该蛋白被设计用于模拟天然 HIV 包膜的三聚体顶端结构。
2. 根据制造商的说明书，使用商用试剂盒（材料表）进行生物素标记。
   1. 根据以下公式计算为实现5倍摩尔过量所需加入反应体系的生物素试剂的毫摩尔数：mmol 生物素 = 蛋白液体积（mL）×（蛋白质量（mg）/蛋白液体积（mL））×（生物素毫摩尔数（mmol）/蛋白质量（mg））×（5 mmol 生物素/mmol 蛋白）。然后使用以下公式计算需加入的生物素试剂体积（µL）：µL 生物素 = mmol 生物素 × (1,000,000 µL/L) × (L/10 mmol)。
   2. 在打开前将生物素试剂平衡至室温。根据上述计算结果，将蛋白溶解于 0.5−2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   3. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制 10 mM 的生物素试剂溶液，并将适当体积的 10 mM 生物素试剂加入蛋白溶液中，冰上孵育 2 小时或室温孵育 30 分钟。
3. 使用蛋白浓缩装置（聚醚砜 [PES] 膜，3 kDa 分子量截留值 ....

结果

图 1：从母乳中分离细胞的流式细胞术示例数据。 细胞按本方案所述方法进行处理和染色。（A）通过 FSC-H 与 FSC-A 散点图设门选择单细胞，以排除双联体，并如图所示在 FSC-A 中排除小于 5,000 的微小碎片 <5,000。（B）利用该细胞群体在 SSC 与 V450（活率染料）散点图中设门获取活细胞（不被活率染料染色的细胞）。（C）将这些活细胞展示于 FSC 与 SSC 散点图中。图中高亮区域（“E”）为非白细胞的预期位置，主要可能为乳腺上皮细胞。（D）同一 FSC 与 SSC 散点.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 µm FluoSpheres NeutrAvidin标记微球	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE小鼠抗人CD45	BD	560975
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	8810025
Corning V型底聚苯乙烯96孔板	Corning	3894
细胞松弛素D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-生物素试剂盒	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL圆锥形离心管	Corning	352196
Falcon 50 mL圆锥形离心管	Corning	352070
可固定活力染料450	BD	562247
甲醛溶液	Sigma	252549
不含钙、镁和酚红的HBSS	Life Technologies	14175-095
人BD Fc阻断剂	BD	564219
人血清白蛋白	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes精细任务擦拭纸	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
聚苯乙烯10 mL移液管	Corning	4488
蛋白浓缩器PES，3K MWCO，0.5 mL	Pierce	88512