作者无任何利益冲突需要披露。

哺乳动物组织的激光显微切割

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

激光捕获显微切割，又称激光显微切割（LMD），可使操作者从冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中分离出少量细胞或组织。LMD 技术依赖于置于组织切片上方或下方的热敏膜。其中一种方法利用聚焦激光能量将膜熔融至下方细胞表面，随后可将这些细胞从组织切片中提起；另一种方法则通过激光能量沿在组织上“绘制”的路径汽化金属箔，使选定细胞落入收集装置。两种技术均可实现数微米级分辨率的细胞选择。可从显微切割样本中分离并分析 DNA、RNA、蛋白质和脂质。本视频通过七个部分演示了 Leica AS-LMD 激光显微切割仪的使用，包括 LMD 原理简介、仪器初始化、样本制备的一般注意事项、标本安装与捕获管设置、显微镜校准、捕获参数调节以及组织标本捕获。激光捕获显微切割使研究者能够分离出仅相当于数个细胞量级的纯细胞群体样本，从而对目标细胞进行分析，避免邻近细胞污染对实验结果造成干扰。

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激光捕获显微技术，又称激光显微切割（LMD），可使用户从冷冻或...

您好，我叫 Rob Edwards，是加州大学尔湾分校激光显微切割实验室的负责人。接下来我将为您介绍我们这里所使用的激光显微切割仪的使用方法。我们的仪器是 Leica A-S-L-M-D，大约在三年前购入。激光捕获系统有两种不同类型。其中一种类似于点焊装置，即将组织样本置于载玻片上，其上方覆盖一层塑料膜，塑料膜位于组织之上。然后使用激光光源熔化膜，在实质上将组织点焊到膜上，随后移除该膜，从而带走捕获的组织。好的。要启动LCM系统，我们需要按顺序依次打开多个仪器的电源。首先打开此处的A-S-L-M-D控制箱电源。然后打开计算机，操作非常简单。如果您的样本需要使用荧光光学系统来识别待捕获的细胞，则需打开汞灯以提供荧光照明。但本次演示中不会使用该功能。如果要拍摄处理前和处理后样本的高质量图像，可以在打开逻辑盒和计算机后，单独在此处开启点相机；接着在此处打开激光功率控制单元，该单元实际上是由仪器底部后方的钥匙开启的；最后，打开计算机显示器。屏幕上会显示多个需要您熟悉掌握的控制选项。你会经常使用它们。这是一个经典的基于 Microsoft Windows 的程序，因此会涉及多个菜单，我们将逐一讨论。但首先，让我介绍一下这里的桌面。有一个实时窗口，可显示显微镜实际观察到的内容。在上方的菜单栏中，您可以看到一个用于实时成像的按钮，还有一个冻结按钮，可进行切换，然后使用文件菜单来捕获组织某一部分的静态图像，例如在捕获前和捕获后分别记录所分离的组织。显微镜可运行于明场或荧光模式，具体取决于您是在采集经血红素复染的组织还是荧光染色的组织。接下来的两个按钮包括标本模式，该模式聚焦于显微镜载物台的平面；然后是收集模式，该模式将玻片移开，使您能够观察收集管顶部所捕获的组织。这是一种质量控制类型的设置。在菜单栏中接下来的是多种绘图工具，您将使用这些工具来标识希望捕获的组织或细胞区域。然后在屏幕右侧有一些额外的绘图和捕获工具，包括一些绘图形状选项、一些切割选项，以及切割控制按钮。此外，在底部的控制面板上还有收集装置，即显微镜载物台下方的部分，用于容纳收集组织样本的 einor 管。标有 A、B、C 和 D 的这四个按钮用于控制哪一个收集管将被移动到待捕获样本的正下方。这是一个用于激光捕获显微切割的典型冷冻切片组织示例。这些是小鼠胚胎头部的冠状切片，已采集到笔箔载玻片上。这些切片为8 µm厚的冷冻切片，经干燥后用伊红复染，并在使用前于-80 °C保存。因此，将这些玻片安装到显微镜上时，显微镜配备有专用的持载装置，需注意组织将被采集到位于载物台平面下方的艾诺管中。因此，组织位于玻片的这一侧，实际安装时应将玻片有组织的一侧朝下放入持载装置中，如下所示。载玻片卡入该位置，并通过弹簧压力固定。然后保持完整，对准此孔。将载玻片夹置于显微镜载物台上，位于这两个导向装置之间。您会注意到有一个小的卡槽，可嵌入载物台后部的夹子下方，以固定样本位置。当其插入到位时，您会感觉到明显的“咔哒”声。接下来需要设置的是艾农管（einor tubes），它将用于实际采集组织。可以选择使用0.2毫升或0.5毫升的einor管，它们可插入这些小型支架中，支架再放入此托盘，托盘则置于载物台下方的专用插槽内。组织实际上将被收集在einor管盖的顶部。此处为说明目的，我使用的是0.5毫升的einor管。因此，将盖子以这种方式滑入下方，盖子的边缘由这些齿状结构固定，然后盖子会像这样卡在下方，之后将整个盖子放入支架中。如果正在进行核酸捕获，特别是用于RNA提取，可以直接在盖子内加入数百微升的裂解液（triol溶液）。需要注意的是，切勿将此液体溅入仪器内部，因为裂解液中含有苯酚及其他腐蚀性化学物质。如我之前所述，这是显微镜控制器，该仪器的物镜、照明和对焦均为全电动化。因此，对焦旋钮位于此处顶部。载物台的Y轴平移控制旋钮是这个旋钮。X轴平移控制装置位于此处。左下方是光圈控制装置，用于调节照明强度，显微镜会记忆在每个放大倍数下所设置的照明强度。因此，当您在不同物镜之间切换时，照明强度会自动调整。最后，在控制器右侧是物镜转换器控制装置，用于在不同物镜之间切换。该仪器配有五个物镜，分别为 4 倍、10 倍、20 倍、40 倍和 63 倍物镜。实际捕获组织的第一步是调整显微镜，使屏幕上显示的内容与将要捕获的图像保持一致，从而完成显微镜的对准。我们进入激光菜单选项，选择校准，然后确认并点击继续。现在我处于4倍放大设置下，可以看到此处膜的区域相对较大。请注意，没有组织存在。我们在载玻片的一个角落进行对齐。激光在屏幕的右上角切割出一个十字交叉标记，我将使用鼠标将其居中对准该屏幕中的十字交叉，然后点击，或者对准该十字交叉并点击，计算机会再切割出另一个十字交叉。我将与新的十字交叉对齐后点击，接着它会切割出第三个十字交叉，我们再在此处完成对齐。显微镜的四倍物镜校准现已完成，已对齐并可实际采集组织。在对齐过程中，您可能注意到所切割的十字标记相对较粗。这实际上是由于激光控制功率被设置得过高所致。我们可能并不需要那么高的切割功率。接下来，我将通过切割一条线来演示如何调节激光功率。如果我在屏幕上手绘一条对角线，然后选择一个盖子，再过来点击“开始切割”，计算机就会沿着我定义的路径进行切割。你可以看到这条线有多宽。我需要降低激光功率。请执行此操作。我进入激光菜单，选择控制选项，您会注意到激光强度已被调至最大。我将把激光强度降低至大约30左右，并确认该设置。现在，如果我绘制一条新线并进行切割，您会看到被烧灼组织或被烧灼膜的宽度明显减小。因此，根据一般原则，应将激光控制功率设置为尽可能低的水平，以最大限度地减少被汽化的组织量。接下来，我将使用这个镜像眼实际演示对一些组织的捕获过程。目前我正处于显微镜的物镜下，将尝试捕获相对较大范围的组织。我们将从这只眼睛的中心完整地分离出晶状体。为此，我将进行徒手切割。利用屏幕顶部的绘图控制工具，我将进行切割。我将围绕待采集的样本绘制一个轮廓。目前使用的是非常低的放大倍数。如果需要更精确的切割或更小的组织区域，显然可以在更高的放大倍数下进行采集。我已经选定了需要切割的区域，接下来进入“绘制形状”菜单，我通常会保持“闭合线条”选项处于开启状态。“闭合线条”的作用是：当围绕某个对象绘制不规则形状时，若未完全封闭要捕获的对象，系统会在形状的开口两端之间自动绘制一条直线将其闭合。因此，在确定了待切割区域后，我们将启动切割过程，此时您会看到控制箱引导激光聚焦通过所选区域，并几乎将该区域完全切割分离。在捕获较大组织片段时，我们经常遇到组织悬垂的情况。此时组织无法完全分离。因此，首先要尝试的是再次进行切割，激光会沿着组织边缘继续切割。有时，你也可以直接在组织悬垂的位置，画出一个小空间并将其切割，这样组织就会脱落。因此，我们现在已成功捕获了这部分组织。正如我之前提到的，我们可以切换到收集模式，确认该组织片段确实已进入收集器或eppendorf管盖中。因此，我将点击上方的采集控制按钮，按下后，显微镜的视野将随之改变。现在我们看到的是支气管管腔的内表面，屏幕右下角显示已捕获的组织片段，通过调焦可清晰观察到单个细胞。由此我们确认，确实成功捕获了所选定的组织样本。现在，由于所捕获的组织本质上类似于飘落的叶片，因此捕获过程无法达到百分之百的效率。有很小比例的被捕获组织碎片可能不会落入捕获管盖内，但一旦完成目标组织的捕获，其损失率非常低。下一步自然是将装有捕获组织的捕获管从仪器上取下，并牢固地盖上管盖。为此，我们需非常轻柔地将支架笔直向外拉出。然后注意保持管盖朝上，将支架从托盘中取出，再非常轻柔地将试管从支架中抽出。以这种方式滑动，将试管移出支架，然后以这种方式移动内管，而不是管盖。现在，如果已在管盖中加入一滴裂解液（TRIOL），您的组织样本便已开始溶解过程，此时可返回实验室继续完成RNA提取。目前有多个厂商生产用于微量样本的RNA提取试剂盒，其中我们更倾向于选择Amon公司生产的产品。整个过程仅此而已。今天，我向大家介绍了加州大学欧文分校的激光捕获显微切割设施。我们演示了如何从聚乙烯萘膜包被的载玻片上捕获冷冻切片组织，以备从中分离RNA。感谢您的关注，祝您在进行激光捕获显微切割时取得成功。

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生物学

激光捕获显微切割哺乳动物组织

激光捕获显微切割，又称激光显微切割（LMD），可使操作者从冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中分离出少量细胞或组织。LMD 技术依赖于置于组织切片上方或下方的热敏膜。其中一种方法利用聚焦激光能量将膜熔融至下方细胞表面，随后可将这些细胞从组织切片中提起；另一种方法则通过激光能量沿在组织上“绘制”的路径汽化金属箔，使选定细胞落入收集装置。两种技术均可实现数微米级分辨率的细胞选择。可从显微切割样本中分离并分析 DNA、RNA、蛋白质和脂质。本视频通过七个部分演示了 Leica AS-LMD 激光显微切割仪的使用，包括 LMD 原理简介、仪器初始化、样本制备的一般注意事项、标本安装与捕获管设置、显微镜校准、捕获参数调节以及组织标本捕获。激光捕获显微切割使研究者能够分离出仅相当于数个细胞量级的纯细胞群体样本，从而对目标细胞进行分析，避免邻近细胞污染对实验结果造成干扰。

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哺乳动物组织的激光显微切割

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