利用钙离子指示剂染料评估T细胞受体诱导的钙离子内流

摘要

来源：Perrenoud, L. 等，利用全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流 J. Vis. Exp. (2022)

本视频分析T细胞受体诱导的T细胞内钙离子流入。抗CD3抗体激活T细胞信号通路，导致细胞内钙离子浓度升高，钙离子与Indo-1染料结合。在流式细胞术中，光谱从无钙状态向钙结合状态的偏移 反映了T细胞受体诱导的钙离子内流。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠脾脏免疫细胞的制备

注意：使用二氧化碳（CO₂） 安乐死法处死未处理小鼠。实验使用6至12周龄的C57BL/6小鼠，购自Jackson Laboratories，并在本机构内繁育。实验中同时使用雄性和雌性小鼠。

1. 用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒，以减少外部污染物进入样本的可能性。
2. 使用解剖工具、手术剪和镊子解剖小鼠脾脏。取出脾脏，并将分离的脾脏置于含有约5 mL冰上预冷的完全RPMI培养基（cRPMI）的50 mL锥形管中。 
   注意： 完全RPMI培养基由10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素组成。
   1. 为了获取小鼠脾脏，使用剪刀在小鼠左侧、前腿与后腿之间中点处的毛皮上做一个约5 cm的切口。打开体腔约5 cm，用镊子取出脾脏。脾脏呈肾豆色，比邻近的肾脏更长且更扁平。
3. 将步骤1.2中的内容倒入无菌70 µ将滤膜连接至新的50 mL离心管。使用5 mL注射器推杆将脾脏压过滤膜，机械分离成单细胞悬液，直至滤膜表面无残留脾组织。<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔 TC 处理板	Cell Treat	229111
50 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio1	41-12-17-03	带盖的 50 mL 聚丙烯离心管
5 mL 聚苯乙烯流式管	Corning	352052
5 mL 注射器	BD 注射器	309646	仅使用活塞，针鞘丢弃
70 µm 滤膜	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC 裂解缓冲液	Gibco	A1049201
Aurora 光谱流式细胞仪	https://cytekbio.com/pages/aurora
恒温混匀金属珠	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d 四聚体 APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
细胞培养箱	Formal Scientific
解剖工具 镊子	McKesson	#487593	组织镊子 McKesson Adson 4-3/4 英寸长度 办公级不锈钢 非无菌 无锁定 拇指柄 1×2 齿
解剖工具 剪刀	McKesson	#970135	手术剪 McKesson Argent™ 4-1/2 英寸 外科级不锈钢 指环柄 直头 锐利尖端/锐利尖端
DPBS 1×	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclone	SH30071.03	批号 AE29165301
FlowJo 软件	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM 乙酰甲酯染料	ebioscience	65-085-39	钙离子负载染料
离子霉素	Millipore	407951-1mg
活/死细胞染料 Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
微量离心管 1.7 mL	Light Labs	A-7001
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
纯化抗小鼠 CD16/CD32（FC 屏蔽）（2.4G2）	Tonbo	70-0161-M001	FC 阻断剂
RPMI	Gibco	1875093	+ 酚红
RPMI 无酚红	Gibco	11835030	-酚红
台式离心机	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu 试剂包		产品编号：C06019	包含台盼蓝
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
水浴锅	Fisher Brand 干式恒温器