利用钙离子指示剂染料评估T细胞受体诱导的钙离子内流

摘要

来源：Perrenoud, L. 等，利用全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流 J. Vis. Exp. (2022)

本视频分析T细胞受体诱导的T细胞内钙离子流入。抗CD3抗体激活T细胞信号通路，导致细胞内钙离子浓度升高，钙离子与Indo-1染料结合。在流式细胞术中，光谱从无钙状态向钙结合状态的偏移 反映了T细胞受体诱导的钙离子内流。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠脾脏免疫细胞的制备

注意：使用二氧化碳（CO₂） 安乐死法处死未处理小鼠。实验使用6至12周龄的C57BL/6小鼠，购自Jackson Laboratories，并在本机构内繁育。实验中同时使用雄性和雌性小鼠。

1. 用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒，以减少外部污染物进入样本的可能性。
2. 使用解剖工具、手术剪和镊子解剖小鼠脾脏。取出脾脏，并将分离的脾脏置于含有约5 mL冰上预冷的完全RPMI培养基（cRPMI）的50 mL锥形管中。 
   注意： 完全RPMI培养基由10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素组成。
   1. 为了获取小鼠脾脏，使用剪刀在小鼠左侧、前腿与后腿之间中点处的毛皮上做一个约5 cm的切口。打开体腔约5 cm，用镊子取出脾脏。脾脏呈肾豆色，比邻近的肾脏更长且更扁平。
3. 将步骤1.2中的内容倒入无菌70 µ将滤膜连接至新的50 mL离心管。使用5 mL注射器推杆将脾脏压过滤膜，机械分离成单细胞悬液，直至滤膜表面无残留脾组织。
4. 利用摆动转子台式离心机以500 × g离心沉淀脾细胞 x g 4℃下5分钟 ˚C.
5. 小心倾倒上清液。沉淀的脾细胞仍留在50 mL锥形管底部。
6. 为去除红细胞，按照说明书，将沉淀的脾细胞重悬于1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，孵育3分钟。充分混匀。
7. 用15 mL cRPMI终止ACK裂解缓冲液。
8. 按照步骤1.4的指示离心收集淋巴细胞。
9. 在50 mL锥形管中，用5 mL cRPMI重悬细胞悬液。将样品置于冰上。
   1. 为计数细胞，转移10 µ将细胞悬液的 L 加入 0.6 mL 微量离心管中，与台盼蓝溶液按 1:1 比例稀释。然后转移至血细胞计数板或自动细胞计数系统。
10. 计数后，根据步骤1.9中细胞悬液的细胞浓度，将细胞在台式离心机中以500 × g离心收集 x g 在 4 ˚5 分钟，为加入含 Indo-1 AM 酯染料的 cRMPI 培养基做准备。
11. 计算重悬细胞的体积，以获得 10-12 x 10⁶ 细胞/mL。这是所需总细胞数的2倍浓度。
12. 在步骤 1.11 中计算出的 cRPMI 体积中重悬细胞。将细胞置于 37 ˚C，5% CO₂₂ 在50 mL锥形管（管盖通风）或组织培养板中。

2. Indo-1 比值型荧光染料与荧光抗体标记

1. 根据制造商说明书，将 50 µL 二甲基亚砜（DMSO）加入含有 50 µg Indo-1 AM 的小瓶中。储备液浓度为 1 µg/µL。
   注意：DMSO 随试剂盒以微型小瓶提供，以防止 DMSO 发生氧化。
2. 将储备液（1 µg/µL）按 6 µg/mL 的浓度（即 2 倍浓度）稀释至适当体积的 cRPMI 培养基中（体积已在步骤 1.11 中确定）。切勿将 Indo-1 储存于水溶液中。
   注意：可根据细胞需求使用其他含钙添加剂的缓冲液。
3. 将含 Indo-1 的完全培养基置于 37 ˚C 水浴中备用。
   注意：应使用获得足够信号所需的最低 Indo-1 AM 酯浓度。该浓度需根据不同细胞类型进行滴定优化。通常 3–5 µM 的浓度已足够。对于原代 T 细胞，若 Indo-1 加载浓度>5 µg/mL，则在光谱流式细胞仪上平均荧光强度（MFI）会超过 6 个对数级。若发生此情况，应降低紫外（UV）激光强度，并将 Indo-1 浓度滴定至更低水平。
4. 将先前制备的细胞悬液（步骤 1.12）用含 2 倍浓度 Indo-1 的 cRPMI 培养基按 1:1 比例稀释，确保细胞浓度维持在 5–6 × 10⁶/mL。
   注意：切勿对未染色单染对照或表面标记单染对照细胞使用 Indo-1 染色。向单染抗体对照中添加 Indo-1 会导致因 Indo-1 加入单染细胞而形成多色样本。请在步骤 2.6 所建立的样本板中加入 Indo-1（无钙）乙二醇双四乙酸（EGTA）处理的对照。
5. 将 1 mL 细胞悬液按不同实验条件分别加入 12 孔组织培养板的各孔中。
6. 使用先前已加载 Indo-1 荧光染料的细胞，制备 Indo-1（无钙）单染对照，并加入 EGTA 至终浓度为 2 mM。EGTA 可螯合细胞悬液中的钙离子，从而获得更清晰的对照样本。
   1. 在流式细胞仪上，向已染色的细胞悬液中加入 50 µM 离子霉素，以建立 Indo-1 阳性对照（Indo-1 结合钙状态）。离子霉素是一种膜通透性钙离子载体，可结合钙离子并促进其跨膜进入细胞。
7. 设置一个不含任何荧光染料或 Indo-1 染料的生物学阴性对照孔。
8. 根据流式细胞术检测 panel 设计，针对其他感兴趣的细胞亚群（由用户自定义抗体）设置单染对照孔，使用抗体偶联的荧光染料。这些对照中不包含 Indo-1 比值型染料。
9. 按照制造商说明书，在进行表面染色前，预先加入 Fc 受体阻断抗体（约 2 µg/1 × 10⁶ 细胞）。
10. 将培养板置于 37 ˚C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟。
11. 每 15 分钟轻轻敲击 12 孔板，使细胞重新悬浮。
12. 混匀后，将 12 孔板中全部细胞悬液转移至 1.7 mL 微量离心管中。
13. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。弃去上清液，加入 1 mL 预热的 cRPMI 洗涤细胞。再次离心并弃去上清液。
    注意：洗涤步骤可去除残留的 Fc 阻断抗体。
14. 将细胞重悬于 1 mL cRPMI 中，转移至 1.7 mL 微量离心管，于 37 ˚C、5% CO₂ 条件下继续孵育 30 分钟，管盖略微打开以利于气体交换。此步骤可确保细胞内 AM 酯完全去酯化。
15. 如需，可将细胞转移回 12 孔组织培养板。可在静息阶段加入用户自定义滴定浓度的荧光染料偶联抗体。
    注意：本方法 panel 中使用的标记物包括：Ghost 540、CD4、CD8、TCRβ、TCRγδ、CD25 和 CD1d/α-galcer 四聚体。这些标记物用于分析 T 细胞亚群。
    1. 根据感兴趣的细胞类型，在 1.7 mL 微量离心管中按先前滴定确定的体积配制所有用户自定义荧光染料偶联抗体的主混合液。
    2. 根据滴定后的抗体用量，计算出适用于 1 mL 细胞体积的主混合液量，并加入静息细胞中。
       注意：在步骤 2.15 而非后续步骤 2.18 进行染色的优势在于可缩短实验整体孵育时间。然而，在步骤 2.15 以 1 mL 总体积进行染色会增加抗体用量。
16. 静息后，在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
    注意：12 孔组织培养板中的细胞可使用板式离心附件直接在板内离心；否则，应转移至 1.7 mL 微量离心管中离心。
17. 用 1 mL 4 ˚C 冷 cRPMI 重悬细胞沉淀并再次离心（同步骤 2.16），随后将细胞置于冰上。
    注意：若在去酯化后（步骤 2.18）单独进行表面染色，则所需抗体体积更少。此步骤可在冰上使用用户自定义抗体、在冷流式缓冲液（含 1% FBS 的 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS））中孵育 30 分钟完成。染色后按步骤 2.17 使用 cRPMI 洗涤细胞。
    1. 根据制造商说明书，将活力染料 Ghost540 用 DPBS 按 1:7,500 稀释后加入样本。为制备单染活/死对照，将部分细胞在加热块上 55 ˚C 加热致死。
       注意：用于流式细胞术分析中排除死细胞的活力功能染料染色应在无 FBS 条件下进行。根据制造商说明，FBS 可能与胺类染料发生相互作用。
18. 使用带盖的 5 mL 聚苯乙烯流式管，将各单个样本重悬于 500 µL 无酚红 cRPMI 中。
    注意：细胞可在 4 ˚C 保存最多一小时。
19. 在流式细胞仪分析前，使用珠浴将每个含细胞的 5 mL 管单独加热至 37 ˚C，持续 7 分钟，确保各样本处理时间一致。请使用计时器控制时间。

3. 珠浴管：钙流分析过程中维持温度

1. 将浴珠加入一个未加水的小型水浴装置中，加热至37 ˚C.
2. 用剃刀在50 mL锥形管的25 mL刻度处小心将其切成两半，丢弃管子上半部分。
3. 填充半截试管 ¾ 浴珠的使用方法。
4. 将步骤 3.2 中制备的试管放入步骤 3.1 中制备的珠浴中。将试管和珠子置于 37 ˚C.
5. 将 bead 浴连接至流式细胞仪旁边的电源插座，以维持温度，为样品分析做好准备。
6. 添加一个已裁剪为可容纳单管的50 mL锥形泡沫塑料架，用于在流式细胞仪运行过程中固定试管位置。这将避免在整条曲线分析期间手动持管的需要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔 TC 处理板	Cell Treat	229111
50 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio1	41-12-17-03	带盖的 50 mL 聚丙烯离心管
5 mL 聚苯乙烯流式管	Corning	352052
5 mL 注射器	BD 注射器	309646	仅使用活塞，针鞘丢弃
70 µm 滤膜	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC 裂解缓冲液	Gibco	A1049201
Aurora 光谱流式细胞仪	https://cytekbio.com/pages/aurora
恒温混匀金属珠	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d 四聚体 APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
细胞培养箱	Formal Scientific
解剖工具 镊子	McKesson	#487593	组织镊子 McKesson Adson 4-3/4 英寸长度 办公级不锈钢 非无菌 无锁定 拇指柄 1×2 齿
解剖工具 剪刀	McKesson	#970135	手术剪 McKesson Argent™ 4-1/2 英寸 外科级不锈钢 指环柄 直头 锐利尖端/锐利尖端
DPBS 1×	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclone	SH30071.03	批号 AE29165301
FlowJo 软件	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM 乙酰甲酯染料	ebioscience	65-085-39	钙离子负载染料
离子霉素	Millipore	407951-1mg
活/死细胞染料 Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
微量离心管 1.7 mL	Light Labs	A-7001
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
纯化抗小鼠 CD16/CD32（FC 屏蔽）（2.4G2）	Tonbo	70-0161-M001	FC 阻断剂
RPMI	Gibco	1875093	+ 酚红
RPMI 无酚红	Gibco	11835030	-酚红
台式离心机	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu 试剂包		产品编号：C06019	包含台盼蓝
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
水浴锅	Fisher Brand 干式恒温器