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方法文章

利用钙离子指示剂染料评估T细胞受体诱导的钙离子内流

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Perrenoud, L. 利用全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流 J. Vis. Exp. (2022)

本视频分析T细胞受体诱导的T细胞内钙离子流入。抗CD3抗体激活T细胞信号通路,导致细胞内钙离子浓度升高,钙离子与Indo-1染料结合。在流式细胞术中,光谱从无钙状态向钙结合状态的偏移 反映了T细胞受体诱导的钙离子内流。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠脾脏免疫细胞的制备

注意:使用二氧化碳(CO2) 安乐死法处死未处理小鼠。实验使用6至12周龄的C57BL/6小鼠,购自Jackson Laboratories,并在本机构内繁育。实验中同时使用雄性和雌性小鼠。

  1. 用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒,以减少外部污染物进入样本的可能性。
  2. 使用解剖工具、手术剪和镊子解剖小鼠脾脏。取出脾脏,并将分离的脾脏置于含有约5 mL冰上预冷的完全RPMI培养基(cRPMI)的50 mL锥形管中。 
    注意: 完全RPMI培养基由10%胎牛血清(FBS)、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素组成。
    1. 为了获取小鼠脾脏,使用剪刀在小鼠左侧、前腿与后腿之间中点处的毛皮上做一个约5 cm的切口。打开体腔约5 cm,用镊子取出脾脏。脾脏呈肾豆色,比邻近的肾脏更长且更扁平。
  3. 将步骤1.2中的内容倒入无菌70 µ将滤膜连接至新的50 mL离心管。使用5 mL注射器推杆将脾脏压过滤膜,机械分离成单细胞悬液,直至滤膜表面无残留脾组织。<....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 孔 TC 处理板Cell Treat229111
50 mL 圆锥形离心管Greiner Bio141-12-17-03带盖的 50 mL 聚丙烯离心管
5 mL 聚苯乙烯流式管Corning352052
5 mL 注射器BD 注射器309646仅使用活塞,针鞘丢弃
70 µm 滤膜Greiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC 裂解缓冲液GibcoA1049201
Aurora 光谱流式细胞仪https://cytekbio.com/pages/aurora
恒温混匀金属珠coleparmerItem # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d 四聚体 APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
细胞培养箱Formal Scientific
解剖工具 镊子McKesson#487593组织镊子 McKesson Adson 4-3/4 英寸长度 办公级不锈钢 非无菌 无锁定 拇指柄 1×2 齿
解剖工具 剪刀McKesson#970135手术剪 McKesson Argent™ 4-1/2 英寸 外科级不锈钢 指环柄 直头 锐利尖端/锐利尖端
DPBS 1×Gibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBSHycloneSH30071.03批号 AE29165301
FlowJo 软件https://www.flowjo.com/
Indo1-AM 乙酰甲酯染料ebioscience65-085-39钙离子负载染料 
离子霉素Millipore407951-1mg
活/死细胞染料 Ghost 540Tonbo13-0879-T100
微量离心管 1.7 mLLight LabsA-7001
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺Gibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
纯化抗小鼠 CD16/CD32(FC 屏蔽)(2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC 阻断剂
RPMIGibco1875093 + 酚红
RPMI 无酚红Gibco11835030 -酚红
台式离心机Beckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu 试剂包产品编号:C06019包含台盼蓝
Vi-Cell BluBeckman Coulter
水浴锅Fisher Brand 干式恒温器

标签

Indo 1 CD3 Fc Indo 1 Indo 1