一种定量检测人诺如病毒样颗粒与肠道细菌结合能力的实验方法

摘要

来源：Madrigal, J. L.，等。利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了一种用于定量人诺如病毒类病毒颗粒（VLPs）与人肠道细菌结合的检测方法。将细菌悬液与VLPs混合并孵育，以形成VLP-细菌复合物。随后用荧光标记的VLP特异性抗体对复合物进行标记，再通过基于流式细胞术的可视化和定量分析，确定结合VLP的细菌百分比。

方案

1. VLP-细菌结合实验

注意：人诺如病毒病毒样颗粒（VLPs）属于生物安全二级（BSL-2）危害物，所有涉及VLPs的操作均应在生物安全柜中进行。在进行黏附实验前的细菌培养制备，应根据所用生物体的特性采取相应的安全防护措施。

1. 试剂制备​
   1. 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）
      1. 将一包试剂溶解于1 L去离子水（DI水）中，配制1 L的10x PBS溶液。
      2. 将溶液高压灭菌30分钟。
      3. 用去离子水将上述溶液按1:10稀释，得到1x PBS溶液。
      4. 使用0.22 μm滤膜过滤除菌，并于室温保存。
   2. 5% BSA
      1. 将5 g牛血清白蛋白（BSA）粉末加入100 mL PBS中，配制成5%（w/v）的溶液。
      2. 通过涡旋振荡或使用磁力搅拌器搅拌，直至粉末完全溶解。
      3. 使用0.22 μm滤膜过滤除菌。
      4. 将溶液于4 °C保存。
   3. 流式细胞术染色缓冲液（FCSB）
      1. 将购买的FCSB（见材料表）通过0.22 μm滤膜过滤。
      2. 将剩余溶液于4 °C保存。
   4. 5% 封闭缓冲液（BB）
      注意：每次使用前需新鲜配制。
      1. 将0.5 g BSA加入10 mL无菌FCSB中。
      2. 涡旋混匀，冰上放置直至使用。
2. 抗体偶联​
   1. 使用R-PE抗体标记试剂盒，按照制造商说明书将人诺如病毒GII型抗体（见材料表）与R-藻红蛋白（PE）进行偶联（见材料表）。
   2. 将偶联后的抗体避光保存于4 °C，用于后续VLP-细菌结合实验分析。
      注意：在进行VLP-细菌结合实验前，应先对一抗进行滴定，以确定流式细胞术分析所需的合适浓度。每次进行偶联反应以及在结合实验中使用不同细菌时，均应重新进行抗体滴定。
3. 抗体滴定
   1. 将偶联的人诺如病毒GII型抗体进行100倍系列稀释，起始稀释度为1:100，终末稀释度为1:600（共六种稀释度）。
   2. 按以下所述进行病毒结合实验，唯一例外是：在步骤1.5.7中，将细菌沉淀重悬于350 µL的5% BB中。
   3. 将样品均分为七份，每份50 µL。
   4. 向其中六个管中分别加入50 µL不同稀释度的抗体溶液。
   5. 向第七个管中加入50 µL的5% BB作为空白对照（未染色对照）。
   6. 按以下所述对所有样品进行流式细胞术检测。
   7. 将各稀释抗体样品与未染色对照及其他稀释样品进行比较，选择不会导致阳性信号减弱或丢失的最低抗体浓度用于后续实验。
4. 细菌制备
   1. 在适当的液体培养基中，于合适的气体条件下培养细菌40 mL，直至进入稳定期。
      1. 将阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）在LB肉汤培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下需氧培养过夜，以达到稳定期。
      2. 将加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）在MRS（De Man, Rogosa, and Sharpe）肉汤培养基中，置于37 °C水浴中，于避光螺旋盖试管中静置培养18小时，以达到稳定期。
   2. 将处于稳定期的菌液转移至洁净的50 mL锥形离心管中，于2,288 x g离心10分钟，使细菌沉淀。
   3. 弃去上清液，加入13 mL无菌1x PBS重悬菌体。重复此洗涤步骤，共洗涤两次。
   4. 再次离心，弃去上清液，将菌体重悬于20 mL 1x PBS中。
      注意：若菌体沉淀量较少，可适当减少重悬体积。
   5. 测定菌液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）。
   6. 利用标准曲线，确定洗涤后菌液的每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。
   7. 用1x PBS稀释菌液，调整浓度至1 × 10⁸ CFU/mL。
   8. 将1 mL浓度为1 × 10⁸ CFU/mL的细菌培养物转移至所需的1.5 mL离心管中。
   9. 于10,000 x g离心5分钟。
   10. 将细菌沉淀重悬于1 mL无菌5% BSA中。
   11. 于37 °C恒温旋转孵育1小时。
5. 病毒结合​
   1. 在BSL-2生物安全柜内操作，向每管含PBS重悬细菌的样品中加入10 µg人诺如病毒（HuNoV）病毒样颗粒（VLPs）（见材料表），并通过移液充分混匀。
      注意：每批VLP的浓度可能不同，因此加入细菌的体积会因批次而异，应相应调整，确保每管实验中加入10 µg VLP。对于仅含细菌的对照组（如不含VLP的样品），应加入与实验组VLP体积相等的PBS。
   2. 于37 °C恒温旋转孵育1小时。
      ​注意：孵育过程中使用转速设定为40 rpm的试管旋转仪（见材料表）。
   3. 孵育结束后，于10,000 x g离心5分钟。
   4. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL PBS中。
   5. 重复步骤1.5.3和1.5.4的洗涤操作。
   6. 于10,000 x g离心5分钟。
   7. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于150 µL的5% BB中。
6. 抗体染色
   1. 新鲜配制5% BB。
      ​注意：所有使用荧光标记抗体的操作均应在避光条件下进行，且抗体、BB及FCSB应始终置于冰上。
   2. 将人诺如病毒GII型抗体用5% BB稀释，阴沟肠杆菌（E. cloacae）样品稀释1:125，加氏乳杆菌（L. gasseri）样品稀释1:150，每份样品准备50 µL稀释抗体。
   3. 将同型对照抗体以相同方式在5% BB中稀释，每份样品准备50 µL稀释后的同型对照。
   4. 将步骤1.3.7中的每个结合实验样品均分为三份，每份50 µL，转移至洁净的1.5 mL离心管中。
   5. 向第一组样品中加入50 µL BB，作为未染色（Uns）对照组。
   6. 向第二组样品中加入50 µL GII抗体稀释液，最终抗体浓度为阴沟肠杆菌（E. cloacae）1:250，加氏乳杆菌（L. gasseri）1:300，作为染色（AB）样品组。
   7. 向第三组样品中加入50 µL稀释的同型抗体，作为同型对照组（IC）。通过移液充分混匀，于冰上避光孵育30分钟。
   8. 将所有样品于10,000 x g离心5分钟。
   9. 弃去上清液，将样品重悬于100 µL FCSB中。
   10. 将所有样品于10,000 x g离心5分钟，弃去上清液，再将样品重悬于100 µL FCSB中。
   11. 将所有样品于10,000 x g离心5分钟。
   12. 弃去上清液，将样品重悬于150 µL FCSB中。
   13. 将每份样品转移至含有400 µL FCSB缓冲液的FCSB管中，总体积为550 µL。
   14. 样品于4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。
       注意：抗体染色后应在4小时内完成流式细胞术检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带细胞筛帽的5ml聚苯乙烯圆底管	Corning	352235	抗体染色后，将样品转移至该管中用于流式细胞术分析。
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	用于加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）培养的厌氧气体包
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa流式细胞仪
牛血清白蛋白	Fisher Bioreagents	BP1605	用于流式细胞术
流式细胞术染色缓冲液（FCSB）	BD Biosciences	554657	用于流式细胞术
小鼠IgG2b κ同型对照抗体（eBMG2b），PE标记，eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	同型对照抗体。该抗体由厂家提供已偶联形式。
MRS培养基粉末	BD Biosciences	288130	用于培养基制备及加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）的培养。
诺如病毒G2型衣壳单克隆抗体（L34D）	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	诺如病毒GII型抗体。该抗体仅提供未偶联形式，因此在用于所述流式细胞术检测前必须进行荧光标记。本方案中选用PE作为荧光素，但研究者可根据所用流式细胞仪的具体情况选择其他合适的荧光分子。
诺如病毒GII.4型病毒样颗粒（VLP）	Creative Biostructure	CBS-V700	人诺如病毒病毒样颗粒，通过杆状病毒系统制备，并重悬于含10%甘油的磷酸盐缓冲液中。作者通过独立的纳米颗粒追踪分析确定了VLP的颗粒浓度，约为每毫升10¹¹个VLP。根据VLP的蛋白浓度，在VLP结合实验中，每个细菌大约加入200个颗粒。
PBS 10X	Fisher Bioreagents	BP665	使用前稀释至1X。
SiteClick R-PE抗体标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	S10467	用于未偶联抗体的荧光标记偶联。
氯化钠	Fisher Scientific	S271	用于培养基制备
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	用于培养基制备
Tube Revolver	ThermoFisher Scientific	88881001	用于病毒-细菌结合实验。设置为最高转速（40 rpm）。
酵母提取物	BD Biosciences	212750	用于培养基制备
琼脂	Sigma	A7002	用于培养基制备