一种在转基因线虫中检测线粒体自噬的活体实验方法

摘要

来源：Fang, E. F., 等 体外与体内人细胞中线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫和小鼠。 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了一种在Caenorhabditis elegans中研究线粒体自噬的in vivo检测方法。通过将线虫暴露于诱导线粒体自噬的药物后，利用受损线粒体上的线粒体自噬受体DCT-1与自噬体膜蛋白LGG-1之间的共定位，评估线粒体自噬的发生情况。

方案

1. 线粒体自噬的检测在 秀丽隐杆线虫

注意：线虫 C. elegans 可作为在个体水平上检测线粒体自噬的实验平台。有两种品系可用于监测线粒体自噬：（1）靶向线粒体的Rosella（mtRosella），或（2）将线粒体自噬受体DCT-1与GFP融合，并同时将自噬小体标志物LGG-1与Discosoma sp. 红色荧光蛋白（DsRed）融合。

1. 使用 Rosella 生物传感器监测线粒体自噬
   注意： Rosella 是一种分子生物传感器，由对pH不敏感的DsRed与对pH敏感的GFP变体融合而成。该生物传感器利用溶酶体（pH约4.5）与其他细胞区室之间的pH差异，已成功用于监测线粒体自噬过程。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 以及多种哺乳动物细胞系，如 HeLa、HEK293 和 HCT116。我们改进了这一多功能双荧光报告系统，并构建了转基因 秀丽隐杆线虫 表达线粒体靶向 Rosella（mtRosella）的线虫，其体壁肌细胞中可观察到线粒体自噬的诱导，表现为 mtRosella 荧光的 GFP/DsRed 比值降低。
   1. 第1天：挑选在体壁肌细胞中表达线粒体靶向Rosella（mtRosella）的线虫L4期幼虫，转移到铺有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）平板上 大肠杆菌 （OP50）使用解剖显微镜。每个3.5 cm培养皿中放置10–20条线虫，至少准备三个培养皿。将线虫在20 °C的标准温度下培养。
      注意： 参见参考文献了解线虫解剖结构，包括L4幼虫的鉴定，以及制作用于将线虫从一处转移至另一处的挑虫针的方法。
   2. 第5天：通过挑选15–20条L4期转基因幼虫，将其转移至新鲜涂布OP50的NGM平板上，以同步线虫发育。每种实验条件至少使用五个平板。
   3. 第7天：准备用于线粒体自噬相关药物或阳性对照的载体平板。
      1. 杀死 E. coli 在NGM平板上接种OP50细菌，暴露15分钟，光照强度为222 µW/cm² （强度）的紫外光，以确保线粒体自噬诱导化合物不会被细菌代谢。平板必须暴露于2,000 J/m²的紫外光下².
         ​注意： 所需曝光时间（秒）= 2,000 /（（强度，单位为 µW/cm²）× 100）
      2. 将目标化合物加入已铺种线虫的NGM平板表面。作为阴性对照，向对照组平板加入等量的化合物溶剂（如用于溶解化合物的二甲基亚砜（DMSO））。为诱导线粒体自噬的阳性对照，使用线粒体毒性剂百草枯（终浓度8 mM）。加入含有10 µL 8 M百草枯储备液与190 µL ddH₂O的溶液。₂在处理组的琼脂平板顶部加入 O。对于对照组，加入含有 10 µL DMSO 和 190 µL ddH₂O 的溶液。₂琼脂平板的顶部。
         注意： 百草枯工作液可在 4 °C 保存 1 个月。
      3. 轻轻晃动培养板，直至药物或溶剂覆盖整个表面。将培养板盖上盖子，在室温下静置干燥至少1小时，然后转移线虫。
         注意： 也可以在液态NGM凝固前加入药物来制备药物平板。
   4. 第7天：将步骤2.1.2中准备的10–20只出生2天的转基因成年动物转移至含有百草枯、待测化合物或溶剂（DMSO）的培养板中。将转基因动物在20 °C下孵育2天。
   5. 第9天：制备2%琼脂糖垫。每张垫上加入一滴（10 µL）含20 mM左旋咪唑的M9溶液。将转基因动物置于M9-左旋咪唑液滴中，使其固定，用于成像。轻轻盖上盖玻片。
   6. 使用连接到落射荧光显微镜的相机捕获单个转基因动物。以10倍放大倍数获取在体壁肌细胞中表达mtRosella的完整转基因线虫的荧光图像。保存所采集的图像。
   7. 使用 ImageJ 软件处理所获得的图像。分析位于线虫头部的体壁肌细胞，以避免肠道组织中的自发荧光干扰。仅针对每只动物头部区域的荧光图像，测量其平均像素强度值和总面积。如需分析特定兴趣区域：
      1. 在“图像”和“颜色”下拉菜单中选择“分通道”以转换图像。
      2. 使用“自由选择”工具圈选目标荧光区域。
      3. 在“分析”下拉菜单中选择“测量”命令，并执行像素强度分析。
      4. 通过将荧光强度除以分析的总面积来对像素强度进行归一化。归一化后，计算GFP与DsRed的比值。
   8. 使用统计分析软件进行学生t检验 t-用于统计分析的双样本t检验（两组间比较）或ANOVA（多组间比较） p < 0.05 作为显著性水平。
2. 利用DCT-1与LGG-1共定位评估线粒体自噬
   注意： DCT-1 是一种定位于线粒体外膜的蛋白，在应激条件下作为线粒体自噬受体发挥作用，功能类似于哺乳动物中的同源蛋白 BNIP3 和 NIX/BNIP3L。因此，通过检测 DCT-1 线粒体自噬受体与自噬小体膜蛋白 LGG-1（哺乳动物 LC3 的同源物）之间的共定位来评估线粒体自噬的启动。
   1. 第1天：挑选在体壁肌细胞中同时表达DCT-1::GFP和DsRed::LGG-1的转基因动物的L4期幼虫，转移至接种了OP50的大肠杆菌的NGM平板上。每3.5 cm平板放置5–10条线虫，至少使用三个平板。将线虫在20 °C条件下培养。
      注意： 转基因位于不同的质粒上，且未整合到基因组中。挑选携带两种质粒的线虫 rol-6(su1006) 和 pmyo-2 GFP 共转化标记。仅在同时具有两种共转化标记的转基因线虫中，体壁肌细胞才会同时表达 DCT-1::GFP 和 DsRed::LGG-1。
   2. 按照步骤 1.1.2 至 1.1.5 进行操作。
   3. 使用连接在共聚焦显微镜上的相机成像单个体壁肌细胞。在63倍放大倍数下检测整个单个体壁肌细胞的边界，并采集z轴层扫图像。也可使用更高放大倍数。
   4. 使用共聚焦软件打开并处理所采集的图像。线粒体自噬的启动通过线粒体自噬受体（DCT-1::GFP）与自噬体标记物（DsRed::LGG-1）的共定位来指示。在每组体壁肌细胞图像序列中手动测量共定位事件。必须保持所有显微镜和相机设置一致（包括物镜与放大镜、滤光片、曝光时间、分辨率、激光强度、增益）， 等等。) 在整个实验过程中保持一致。所有设置均应记录。
   5. 使用统计分析软件进行学生t检验 t-用于统计分析的双样本t检验（两组间比较）或ANOVA（多组间比较） p < 0.05 作为显著性水平。对于双因素比较，使用 Student's t-检验（p < 0.05 被视为具有显著性差异）。对于多重比较，应采用单因素方差分析（ANOVA），并进行校正 事后检验 Bonferroni 检验。我们建议每种实验条件下分析至少 50–70 只动物或 30–50 个体壁肌细胞。每个实验至少重复三次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eclipse TE-2000e 共聚焦显微镜	Nikon	#TE-2000e
共定位分析软件	Volocity	#Volocity 6.3	替代方案：Zeiss ZEN 2012 软件
IN Cell Investigator 软件	GE Healthcare Life Sciences	#28408974
细胞培养基	Thermofisher	#DMEM–Dulbecco 改良 Eagle 培养基
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermofisher	#15140122
胎牛血清	Sigma-Aldrich	#12003C-1000ML
细胞培养孵育箱	Thermofisher	#Thermo Forma 3110 CO2 水套式孵育箱
落射荧光显微镜	Zeiss		Zeiss Axio Imager Z2
相机	Olympus		Olympus DP71
共聚焦显微镜	Zeiss		Zeiss Axio Observer Z1
共聚焦显微镜软件	Zeiss		ZEN 2012
图像分析软件	Image J	用于共定位分析等	https://imagej.nih.gov/ij/
统计分析软件	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism 软件包
制作线虫挑取针的材料	Surepure Chemetals	#4655	挑针由 30 号 90% 铂金和 10% 铱金合金丝制成
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]	材料咨询 Tavernarakis Nektarios		转基因动物在 20 °C 下维持培养
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	材料咨询 Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella	材料咨询 Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP	材料咨询 Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1	材料咨询 Tavernarakis Nektarios
百草枯溶液
M9 缓冲液
M9-左旋咪唑缓冲液
玻璃显微镜载玻片和盖玻片	Fisher Scientific	#B9992000
外科镊子	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
外科剪刀	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS	Thermofisher	#AM9625	10x PBS 需用 ddH2O 稀释至 1x PBS
摇床	Fisher Scientific	#11-676-178	Thermo Scientific MaxQ HP 台式轨道小型开放式平台摇床套装 A
2% 琼脂糖垫
振动切片机刀片	World precision instruments	#BLADES-2	单刃刀片
金属板	MSC	#78803988	厚度 0.012 英寸 × 宽度 6 英寸 × 长度 12 英寸，430 不锈钢板
Triton X-100			去垢剂
甲基紫精二氯化物水合物	Sigma-Aldrich	#856177	百草枯
线虫培养孵育箱	AQUALYTIC		用于维持 20 °C 的孵育箱
解剖体视显微镜	Olympus	SMZ645
共聚焦显微镜	Zeiss	AxioObserver Z1	用于线虫（步骤 2）
落射荧光显微镜	Zeiss	AxioImager Z2	用于线虫（步骤 2）
紫外交联仪	Vilber Lourmat	BIO-LINK – BLX-E365	紫外光源；356 nm