来源：Fang, E. F., 等 体外与体内人细胞中线粒体自噬的检测 秀丽隐杆线虫和小鼠。 视频实验杂志 (2017).
本视频展示了一种在Caenorhabditis elegans中研究线粒体自噬的in vivo检测方法。通过将线虫暴露于诱导线粒体自噬的药物后，利用受损线粒体上的线粒体自噬受体DCT-1与自噬体膜蛋白LGG-1之间的共定位，评估线粒体自噬的发生情况。
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方法文章
一种在转基因线虫中检测线粒体自噬的活体实验方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 线粒体自噬的检测在 秀丽隐杆线虫
注意：线虫 C. elegans 可作为在个体水平上检测线粒体自噬的实验平台。有两种品系可用于监测线粒体自噬：（1）靶向线粒体的Rosella（mtRosella），或（2）将线粒体自噬受体DCT-1与GFP融合，并同时将自噬小体标志物LGG-1与Discosoma sp. 红色荧光蛋白（DsRed）融合。
- 使用 Rosella 生物传感器监测线粒体自噬
注意： Rosella 是一种分子生物传感器，由对pH不敏感的DsRed与对pH敏感的GFP变体融合而成。该生物传感器利用溶酶体（pH约4.5）与其他细胞区室之间的pH差异，已成功用于监测线粒体自噬过程。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 以及多种哺乳动物细胞系，如 HeLa、HEK293 和 HCT116。我们改进了这一多功能双荧光报告系统，并构建了转基因 秀丽隐杆线虫 表达线粒体靶向 Rosella（mtRosella）的线虫，其体壁肌细胞中可观察到线粒体自噬的诱导，表现为 mtRosella 荧光的 GFP/DsRed 比值降低。- 第1天：挑选在体壁肌细胞中表达线粒体靶向Rosella（mtRosell....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Eclipse TE-2000e 共聚焦显微镜 | Nikon | #TE-2000e | |
| 共定位分析软件 | Volocity | #Volocity 6.3 | 替代方案：Zeiss ZEN 2012 软件 |
| IN Cell Investigator 软件 | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| 细胞培养基 | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco 改良 Eagle 培养基 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermofisher | #15140122 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 水套式孵育箱 | |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| 相机 | Olympus | Olympus DP71 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| 共聚焦显微镜软件 | Zeiss | ZEN 2012 | |
| 图像分析软件 | Image J | 用于共定位分析等 | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 统计分析软件 | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism 软件包 | |
| 制作线虫挑取针的材料 | Surepure Chemetals | #4655 | 挑针由 30 号 90% 铂金和 10% 铱金合金丝制成 |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | 材料咨询 Tavernarakis Nektarios | 转基因动物在 20 °C 下维持培养 | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | 材料咨询 Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | 材料咨询 Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | 材料咨询 Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | 材料咨询 Tavernarakis Nektarios | ||
| 百草枯溶液 | |||
| M9 缓冲液 | |||
| M9-左旋咪唑缓冲液 | |||
| 玻璃显微镜载玻片和盖玻片 | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| 外科镊子 | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 外科剪刀 | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS 需用 ddH2O 稀释至 1x PBS |
| 摇床 | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP 台式轨道小型开放式平台摇床套装 A |
| 2% 琼脂糖垫 | |||
| 振动切片机刀片 | World precision instruments | #BLADES-2 | 单刃刀片 |
| 金属板 | MSC | #78803988 | 厚度 0.012 英寸 × 宽度 6 英寸 × 长度 12 英寸，430 不锈钢板 |
| Triton X-100 | 去垢剂 | ||
| 甲基紫精二氯化物水合物 | Sigma-Aldrich | #856177 | 百草枯 |
| 线虫培养孵育箱 | AQUALYTIC | 用于维持 20 °C 的孵育箱 | |
| 解剖体视显微镜 | Olympus | SMZ645 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | AxioObserver Z1 | 用于线虫（步骤 2） |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | AxioImager Z2 | 用于线虫（步骤 2） |
| 紫外交联仪 | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | 紫外光源；356 nm |
