一种用于蛋白质生物标志物检测的毛细管电泳免疫分析法

摘要

来源：Sage, J. M., 等 利用毛细管电泳免疫分析法在人血小板中寻找肌萎缩侧索硬化症的潜在生物标志物。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了一种毛细管电泳免疫分析方案，用于检测人血小板中与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的蛋白质生物标志物。通过基于分子大小对血小板蛋白进行分离，随后进行化学发光检测，从而确认ALS生物标志物蛋白的存在。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 缓冲液与试剂的配制

注意：请按照制造商的指南准备所有样品。在操作过程中，需佩戴个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。

1. 通过将0.941 g蔗糖（终浓度11 mM）、6.4 mL 5 M氯化钠（NaCl，终浓度128 mM）、5.4 mL 0.2 M磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）与100 mL去离子水混合，配制柠檬酸盐洗涤缓冲液₂PO₄，终浓度4.3 mM），0.2 M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）9.4 mL₂HPO₄，终浓度分别为7.5 mM、0.352 g 柠檬酸钠（终浓度4.8 mM）和0.115 g 柠檬酸（终浓度2.4 mM）。用ddH₂O定容至250 mL₂O. 通过0.45 μm滤膜过滤 µm滤纸片，调节pH至6.5。4℃下保存，最长可保存1年 ˚C. 使用前将溶液恢复至室温（RT）。
2. 通过将250 mM蔗糖、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和10 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-Cl，pH 7.4）混合，定容至100 mL，制备裂解缓冲液。4 ℃保存，可存放长达1年。 ˚C. 加入2 µL 磷酸酶抑制剂混合液（终浓度 1:1000）和 1 µ将蛋白酶抑制剂混合液（终浓度1:2000）加入2 mL裂解缓冲液中，置于冰上保存备用。未使用的裂解缓冲液应弃去。

2. 血小板分离

1. 在含有酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）溶液（75 mM 枸橼酸三钠、124 mM 葡萄糖和 38 mM 枸橼酸，pH = 7.4；ACD: 血液 = 1:9）的黄帽采血管中采集 8–10 mL 人血。用手轻轻倒置混匀 5–6 次。
2. 将离心管在200 × g下离心 x g 在室温下以摆桶转子离心20分钟。
3. 收集富血小板血浆（PRP）约 3–4 mL 至 15 mL 圆底离心管中，保留约 0.5 mL PRP 不吸取，以避免吸取到白膜层（外观浑浊的部分），防止污染。若出现任何红细胞污染，需重复此步骤。
4. 将PRP样本在1,200 × g下离心 x g 室温下孵育15分钟。
5. 轻轻重悬血小板沉淀（P1）于1 mL柠檬酸盐洗涤缓冲液中，随后在1,200 × g离心沉淀 x g 室温下孵育15分钟。
6. 保存纯化的血小板沉淀，弃去上清液。
7. 将血小板沉淀重悬于 600 μ含抑制剂混合物的裂解缓冲液 L
8. 使用超声波破碎仪对血小板悬液进行超声处理。将样品置于小型冰桶中。将超声波破碎仪设置为连续模式，强度3，超声20秒。
   注意用10%漂白剂清洁探头，然后用蒸馏水冲洗。
9. 将超声处理的样品在20,000离心 x g 4℃下孵育30分钟 °C以去除膜组分。将上清液分装至60 μL，并在 -80 保存 ˚C. 避免血小板胞质组分反复冻融。

3. 毛细管电泳免疫分析（CEI）的准备工作

注意：将肌萎缩侧索硬化症患者（n = 8–10）和健康受试者（n = 8–10）的血小板裂解物各100 µL分别混合 pooling，用于检测方法的优化。

1. 填写内部生成的CEI布局模板（表1）和样品制备模板（表2）。样品混合物制备表为动态表格，将自动计算需从源样品中移除的体积。
   注意：当在动态表2中输入所需源体积时，系统将自动计算0.1×样品缓冲液体积。
2. 预先标记25个0.2 mL PCR管，编号为毛细管#1–#25，并将其放入PCR管架中。置于冰上。
3. 预先标记0.6 mL微量离心管：每种一抗及其稀释液（如需要）各一个，一个用于0.1×样品缓冲液，一个用于luminol-S/过氧化物，以及每个需要稀释的样品各一个。将这些管子放在冰上的管架中。
4. 取出样品缓冲液、洗涤缓冲液、一块板以及CEI分离12–230 kDa主试剂盒分离模块中提供的卡盒。
5. 从4 °C冰箱中取出抗体稀释缓冲液、一抗、二抗、luminol、过氧化氢和标准品包。除标准品包保持室温外，其余试剂均置于冰上。
   注意：标准品包中的试剂为冻干粉，用铝箔密封。为减少产品损失，打开前应使用小型离心机短暂离心。打开时可用移液枪头刺穿管盖，或从角落处撕开。
6. 配制400 mM二硫苏糖醇（DTT）：向含有DTT的透明管中加入40 µL去离子水。
7. 配制40 µL荧光5×主混合液：向试剂盒提供的粉红色管中加入20 µL 10×样品缓冲液和20 µL已配制的400 mM DTT溶液。
8. 配制生物素化蛋白ladder：向试剂盒提供的白色管中加入16 µL去离子水、2 µL 10×样品缓冲液和2 µL已配制的400 mM DTT溶液。轻轻混匀后转移至0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中用于变性处理。
9. 配制0.1×样品缓冲液：向0.6 mL微量离心管中加入1.5 µL 10×样品缓冲液和148.5 µL去离子水。涡旋混匀后置于冰上。
10. 配制所需浓度的一抗稀释液。将抗体稀释液按指定体积加入已预先标记的微量离心管中。若体积相同，使用反向移液技术；若不同，则在加样前预润洗移液枪头。
    注意：本实验使用了A-TDP-43全抗体和a-p(S409/410-2) TDP-43抗体。抗ERK抗体作为内参对照，以确保实验组分正常工作。
11. 按以下方法进行抗体稀释的反向移液操作。此外，可在文献中找到更多相关信息。
    注意：当连续分配小体积溶液时，推荐使用反向移液技术。该技术具有以下优势：(i) 提供精确体积；(ii) 避免试剂在枪头孔口产生泡沫；(iii) 适用于小体积（<5 µL）试剂、粘稠溶液、表面活性剂溶液以及高蒸气压溶液。
    1. 将合适的枪头安装到移液器上，将按钮压至第二停点（步骤2）。将枪头浸入溶液中几毫米深处，缓慢松开按钮使溶液吸入枪头，期间保持枪头浸没。将枪头从溶液中取出，轻轻触碰试剂容器边缘，以去除枪头外壁残留的多余液体。
    2. 通过将按钮按至第一停点（步骤1）来释放溶液。不要将枪头中剩余的液体排出。
    3. 将枪头中剩余的液体通过按至第二停点（步骤2）排回试剂容器中。松开按钮至待用位置，准备下一步移液操作。
    4. 按指定体积将所需抗体加入各预先标记的微量离心管中（表1）。不要预润洗移液枪头：直接将抗体加入稀释液中，并多次冲洗枪头以彻底转移抗体。将管子置于冰上。
12. 为配制CEI样品混合液，请对编号为cap#2至cap#25的PCR管执行以下步骤：顺序与表1一致。
    1. 打开所有管子，使用反向移液技术向每管加入1.6 µL荧光5×样品缓冲液，加完5×缓冲液后立即关闭各PCR管，以尽量减少样品损失。
    2. 打开所有管子，按表2指定体积向每管加入0.1×样品缓冲液，加完后立即关闭。若体积相同，使用反向移液技术；若不同，则在加样前预润洗移液枪头。
    3. 打开所有管子，按表2指定体积向每管加入蛋白样品，加完后立即关闭。若体积相同，使用反向移液技术；若不同，则在加样前预润洗移液枪头。
    4. 将所有PCR管短暂离心（台式离心机，13,000 x g，30 s），轻弹或涡旋混匀PCR管，然后重复一次离心。
    5. 将所有PCR管转移至带加热盖的热循环仪中。在设定的温度和时间下进行样品变性（例如，95 ˚C 5分钟；70 ˚C 10分钟）。
       注意：变性温度和时间需根据目标蛋白进行优化。
    6. 重复步骤3.12.4。
    7. 将所有PCR管放回管架并置于冰上。
    8. 在变性过程中，配制显影液（1:1 luminol-S:过氧化物溶液），加入200 µL luminol-S和200 µL过氧化物。置于冰上。
    9. 将上述制备的样品加载至CEI预填充板中，按照实验布局图（图1）所示，将试剂和样品加入检测板的相应孔中。避免引入气泡。
       注意：若体积和溶液相同，使用反向移液技术；若不同，则在加样前预润洗移液枪头，并且不要使用移液器第二停点将残余液体排入孔中。12–230 kDa分离模块可能包含一个颜色编码的加样指南。加样时可将此指南置于板下方，以辅助视觉定位。该加样指南也可从公司网站下载。
       1. 向E行每个孔中加入15 µL luminol:过氧化物混合液。
          注意：建议在使用前立即配制该试剂并加入各孔。若操作不便，该混合液可在加样前不超过30分钟内配制。
       2. 在D行，向D1孔加入10 µL链霉亲和素-HRP。
       3. 在D行，向D2–D25孔各加入10 µL指定的二抗。
       4. 在B行，向每个孔加入10 µL抗体稀释液。
       5. 在C行，向C1孔加入10 µL抗体稀释液。
       6. 在C行，向C2–C25孔各加入10 µL指定的一抗。
       7. 在A行，向A1孔加入5 µL来自PCR管#1的生物素化ladder。
       8. 在A行，向A2–A25孔分别加入3 µL样品（来自PCR管#2–#25），对应加入孔#2–#25。
       9. 向每个指定的洗涤缓冲液孔中加入500 µL洗涤缓冲液。
       10. 在室温下以1,000 x g离心5分钟。

表1：CEI检测板加样模板。

表2：交互式样品混合液制备模板。 输入未知样品的蛋白质储备液浓度后，交互式单元格将自动计算出配制样品混合液所需的体积。

结果

图1：实验布局。 本实验可同时完成一抗和目标蛋白样本的优化。毛细管2–7、8–13、14–19和20–24分别代表不同的蛋白浓度和一抗浓度梯度。毛细管25为阳性对照。实验中使用了抗ERK抗体，但也可选用其他合适的阳性对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12-230 kDa 分离试剂盒	ProteinSimple	SM-W004	包含预填充检测板和25通道毛细管卡盒
3000G 温控循环仪	Techne	FTC3G/02	用于加热样品混合物
抗小鼠检测试剂盒	ProteinSimple	042-205	包含HRP标记的二抗、缓冲液、鲁米诺试剂和分子量标记物
抗-P(S409-410) TDP-43 抗体	ProteinTech	22309-1-AP	识别磷酸化TDP-43的一抗
抗-P(S409-412) TDP-43 抗体	CosmoBio-USA	TIP-PTD-P02	识别磷酸化TDP-43的一抗
抗兔检测试剂盒	ProteinSimple	DM-001	包含HRP标记的二抗、缓冲液、鲁米诺试剂和分子量标记物
抗-TDP-43（全）抗体	ProteinTech	10782-2-AP	识别完整TDP-43蛋白的一抗
超声破碎仪；Model100	Fisher Scientific		超声处理设备，用于破裂细胞膜。此型号已停产（替代型号为 XL2000-350）
台式离心机	Eppendorf	22625004	型号# 5810，配备摆动板转子
Wes 分析仪	ProteinSimple	55892-WS-2203	用于执行毛细管凝胶电泳
SimpleWestern (SW) Compass 软件	ProteinSimple	Ver.4.0.0.	SW Compass 是 SimpleWestern 仪器的控制与数据分析应用程序