使用微流控设备的基于磁性纳米粒子的免疫测定

1. 设备准备

1. 使用注射器用蒸馏水填充通道。确保没有泄漏或流动阻力。将设备浸入超声波浴中 10 分钟，以去除通道内残留的丙烯酸、粘合剂或不需要的材料。
2. 排空设备通道内的水。使用注射器引入由 5% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 制备的封闭溶液，该白蛋白在 1x Tris 缓冲盐水 （TBS） 中稀释，并预先通过 0.2 μm 聚醚砜 （PES） 注射器过滤器过滤。
3. 在 5% BSA 中制备直径为 7.5 μm 的铁微粒悬浮液><。 注意: 微粒先前使用二氧化硅-聚乙二醇 （PEG） 层进行功能化，从而赋予蛋白质吸收阻力。
4. 将芯片和微粒悬浮液与封闭溶液在室温下孵育至少 1 小时。如果可能，允许在 4 °C 下封闭过夜。

2. 微粒陷阱的形成

1. 用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。垂直放置芯片，让微粒在重力作用过侧通道。分两步将芯片旋转 180°，每步 90°，让微粒在 5 μm 限制下靶向和压实。
2. 通过重力向侧通道旋转 45° 去除多余的微粒。
3. 保持设备直立以避免撤消微粒捕获器。有关微粒阱形成过程的摘要，请参见图 1B。

3. 免疫测定

1. 纳米颗粒制备
   1. 取 2 μL 先前与溶菌酶（抗原模型）偶联的 100 nm 纳米颗粒的悬浮液。将其添加到含有 100 μL 封闭溶液的 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 下孵育过夜。
   2. 加入 150 μL 洗涤缓冲液（1x TBS，0.05% Tween 20）。
   3. 将 1.5 mL 微量离心管放入磁力分离器中。保持 15 分钟以允许分离纳米颗粒（图 2）.
      注意: 磁选机的最小体积为 200 μL。避免使用更小的体积。
   4. 用微量移液器从试管中取出液体。避免接触形成纳米颗粒颗粒的管壁。
   5. 加入 250 μL 新鲜洗涤缓冲液。将试管搅拌 15 分钟。
   6. 重复步骤 3.1.3.-3.1.5。再摇晃 2 次，仅摇晃 5 分钟。
   7. 添加所需浓度的一抗溶菌酶抗体（参见材料表）。在抗体稀释剂（1x TBS、1% BSA、0.05% Tween 20）中调节至最终体积为 100 μL。
   8. 在 37 °C 下孵育 15 分钟。在室温下继续摇晃 15 分钟。
   9. 重复洗涤步骤 3.1.2.-3.1.6。
   10. 加入 100 μL 抗体稀释剂。添加辣根过氧化物酶偶联的二抗 （HRP-AbII）（参见材料表），稀释度为 1:500。
   11. 重复洗涤步骤 3.1.2.-3.1.6。
   12. 将纳米颗粒保存在最终体积为 50 μL 的抗体稀释剂中。

4. 实验性挂载

1. 在两个 100 μL 玻璃注射器中装满水，将一根 6.5 cm 长的软管连接到每个注射器上，将金属针插入软管末端，然后将两个注射器放在计算机控制的注射泵上。
2. 用热量密封丙烯酸装置的所有软管。
3. 剪断入口软管，只保留几毫米。用洗涤缓冲液填充分配针，然后将其插入切割软管中。在将针头连接到设备之前，让溶液滴落，以防止空气进入设备。
4. 从横向通道剪断出口软管。连接到注射泵。接下来，对主通道出口软管执行相同的步骤。
   注意:执行步骤 4.3.-4.4 是关键。以避免打开微粒捕集器的包装。如果可能，请在这些步骤中借助放大镜验证陷阱的状态。
5. 将载玻片放在显微镜载物台上。用双面胶带将磁铁贴在载玻片上，并在每侧放置一小块胶带，以将芯片边缘固定在玻璃上。
6. 通过注射泵控制器中的流速和单位选项卡将流速设置为 50 μL/h。选择 Withdrawing（提取）模式，然后单击 Start（开始）按钮以激活洗涤缓冲液的流速。
7. 小心地将设备水平靠近带有磁铁的载玻片，使包含陷阱的芯片区域与磁铁接触。
8. 用双面胶带将设备的边缘粘在玻璃上，以防止移动。避免阻塞显微镜的光路（图 1C）。

5. 免疫检测

1. 保持洗涤缓冲液以 50 μL/h 的速度流动 10 分钟，以去除多余的 BSA。
2. 用微量移液器从分配针上去除剩余的洗涤缓冲液。加入 50 μL 纳米颗粒悬浮液。
3. 以 100 μL/h 的流速将纳米颗粒的悬浮液流动 7 分钟。随后，将流速更改为 50 μL/h 并再流速 15 min。
4. 更换分配针。以 50 μL/h 的速度将洗涤缓冲液流动 10 分钟。在洗涤步骤中，根据制造商的规格准备荧光底物。
5. 用微量移液器从分配针上去除剩余的洗涤缓冲液。添加 100 μL 荧光底物（参见材料表）。以 50 μL/h 的速度将荧光底物流 6 分钟。
6. 在控制注射泵的界面的相应流速和设置计时器选项卡中设置流速（1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h 和 10 μL/h）和时间（6 分钟）测量参数。请务必为要执行的每项测量选择 Withdrawing mode（提款模式）。
7. 将额外的流速选项卡设置为 50 μL/h，并将计时器设置为 3 分钟以进行洗涤步骤。
在
8. 50 μL/h 的底物停止前 15 秒打开显微镜的荧光。在基板停止前 10 秒使用显微镜相机的软件开始图像捕获，曝光时间为 1,000 毫秒。以 1 帧/秒 （FPS） 的速度进行 6 分钟的成像。
9. 在 50 μL/h 的底物清洗流速停止后，立即点击所需流速参数的"开始"按钮。在选定的测量流量停止后，立即点击清洗液流 （50 μL/h） 的"开始"按钮。
10. 停止图像捕获并关闭显微镜的荧光，以避免基材发生光漂白。
11. 重复步骤 5.8.-5.10。对于使用的每种测量流量。

图 1:最终器件配置。（A） 将软管连接到相应输入和输出的亚克力装置。刻度以厘米为单位显示设备的尺寸。（B） 形成微粒捕集器的方案。当设备放置在垂直位置时，微粒在重力作用过通道。微粒在 5 μm 限制处浓缩。通过侧通道旋转芯片，很容易去除多余的微粒。芯片保持垂直，以便在免疫测定前保留捕获物。（C） 安装在倒置荧光显微镜载物台上包含磁体的载玻片上的微流体装置。观察用于添加试剂的分配针头，以及连接到注射泵的出口软管。

图 2:纳米颗粒分离。 使用商用磁分离器，可以轻松浓缩 100 nm 纳米颗粒，以便在免疫测定过程中执行洗涤步骤。在红色圆圈中观察到 15 分钟后形成的沉淀。