使用微流控设备的基于磁性纳米粒子的免疫测定

摘要

来源:Hernández-Ortiz， J. A.， et al. 用于基于磁性纳米粒子的免疫测定的交错限制的微流体丙烯酸装置的计算机数控微铣削。 J. Vis. Exp.（2022 年）。

该视频演示了用于基于磁性纳米粒子的免疫测定的微流控系统。该检测系统利用微流体装置，在其通道内包含一个磁阱。将预先形成的免疫复合物引入通道，由与一抗和过氧化物酶偶联的二抗结合的抗原包被磁性纳米颗粒组成。免疫复合物在施加外部磁场时被捕获在多孔磁阱中。使用在过氧化物酶催化下发射荧光的荧光底物，在显微镜下检测捕获的免疫复合物。

方案

1. 设备准备

1. 使用注射器用蒸馏水填充通道。确保没有泄漏或流动阻力。将设备浸入超声波浴中 10 分钟，以去除通道内残留的丙烯酸、粘合剂或不需要的材料。
2. 排空设备通道内的水。使用注射器引入由 5% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 制备的封闭溶液，该白蛋白在 1x Tris 缓冲盐水 （TBS） 中稀释，并预先通过 0.2 μm 聚醚砜 （PES） 注射器过滤器过滤。
3. 在 5% BSA 中制备直径为 7.5 μm 的铁微粒悬浮液><。 注意: 微粒先前使用二氧化硅-聚乙二醇 （PEG） 层进行功能化，从而赋予蛋白质吸收阻力。
4. 将芯片和微粒悬浮液与封闭溶液在室温下孵育至少 1 小时。如果可能，允许在 4 °C 下封闭过夜。

2. 微粒陷阱的形成

1. 用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。垂直放置芯片，让微粒在重力作用过侧通道。分两步将芯片旋转 180°，每步 90°，让微粒在 5 μm 限制下靶向和压实。
2. 通过重力向侧通道旋转 45° 去除多余的微粒。
3. 保持设备直立以避免撤消微粒捕获器。有关微粒阱形成过程的摘要，请参见图 1B。

3. 免疫测定

1. 纳米颗粒制备
   1. 取 2 μL 先前与溶菌酶（抗原模型）偶联的 100 nm 纳米颗粒的悬浮液。将其添加到含有 100 μL 封闭溶液的 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 下孵育过夜。
   2. 加入 150 μL 洗涤缓冲液（1x TBS，0.05% Tween 20）。
   3. 将 1.5 mL 微量离心管放入磁力分离器中。保持 15 分钟以允许分离纳米颗粒（图 2）.
      注意: 磁选机的最小体积为 200 μL。避免使用更小的体积。
   4. 用微量移液器从试管中取出液体。避免接触形成纳米颗粒颗粒的管壁。
   5. 加入 250 μL 新鲜洗涤缓冲液。将试管搅拌 15 分钟。
   6. 重复步骤 3.1.3.-3.1.5。再摇晃 2 次，仅摇晃 5 分钟。
   7. 添加所需浓度的一抗溶菌酶抗体（参见材料表）。在抗体稀释剂（1x TBS、1% BSA、0.05% Tween 20）中调节至最终体积为 100 μL。
   8. 在 37 °C 下孵育 15 分钟。在室温下继续摇晃 15 分钟。
   9. 重复洗涤步骤 3.1.2.-3.1.6。
   10. 加入 100 μL 抗体稀释剂。添加辣根过氧化物酶偶联的二抗 （HRP-AbII）（参见材料表），稀释度为 1:500。
   11. 重复洗涤步骤 3.1.2.-3.1.6。
   12. 将纳米颗粒保存在最终体积为 50 μL 的抗体稀释剂中。

4. 实验性挂载

1. 在两个 100 μL 玻璃注射器中装满水，将一根 6.5 cm 长的软管连接到每个注射器上，将金属针插入软管末端，然后将两个注射器放在计算机控制的注射泵上。
2. 用热量密封丙烯酸装置的所有软管。
3. 剪断入口软管，只保留几毫米。用洗涤缓冲液填充分配针，然后将其插入切割软管中。在将针头连接到设备之前，让溶液滴落，以防止空气进入设备。
4. 从横向通道剪断出口软管。连接到注射泵。接下来，对主通道出口软管执行相同的步骤。
   注意:执行步骤 4.3.-4.4 是关键。以避免打开微粒捕集器的包装。如果可能，请在这些步骤中借助放大镜验证陷阱的状态。
5. 将载玻片放在显微镜载物台上。用双面胶带将磁铁贴在载玻片上，并在每侧放置一小块胶带，以将芯片边缘固定在玻璃上。
6. 通过注射泵控制器中的流速和单位选项卡将流速设置为 50 μL/h。选择 Withdrawing（提取）模式，然后单击 Start（开始）按钮以激活洗涤缓冲液的流速。
7. 小心地将设备水平靠近带有磁铁的载玻片，使包含陷阱的芯片区域与磁铁接触。
8. 用双面胶带将设备的边缘粘在玻璃上，以防止移动。避免阻塞显微镜的光路（图 1C）。

5. 免疫检测

1. 保持洗涤缓冲液以 50 μL/h 的速度流动 10 分钟，以去除多余的 BSA。
2. 用微量移液器从分配针上去除剩余的洗涤缓冲液。加入 50 μL 纳米颗粒悬浮液。
3. 以 100 μL/h 的流速将纳米颗粒的悬浮液流动 7 分钟。随后，将流速更改为 50 μL/h 并再流速 15 min。
4. 更换分配针。以 50 μL/h 的速度将洗涤缓冲液流动 10 分钟。在洗涤步骤中，根据制造商的规格准备荧光底物。
5. 用微量移液器从分配针上去除剩余的洗涤缓冲液。添加 100 μL 荧光底物（参见材料表）。以 50 μL/h 的速度将荧光底物流 6 分钟。
6. 在控制注射泵的界面的相应流速和设置计时器选项卡中设置流速（1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h 和 10 μL/h）和时间（6 分钟）测量参数。请务必为要执行的每项测量选择 Withdrawing mode（提款模式）。
7. 将额外的流速选项卡设置为 50 μL/h，并将计时器设置为 3 分钟以进行洗涤步骤。
在
8. 50 μL/h 的底物停止前 15 秒打开显微镜的荧光。在基板停止前 10 秒使用显微镜相机的软件开始图像捕获，曝光时间为 1,000 毫秒。以 1 帧/秒 （FPS） 的速度进行 6 分钟的成像。
9. 在 50 μL/h 的底物清洗流速停止后，立即点击所需流速参数的"开始"按钮。在选定的测量流量停止后，立即点击清洗液流 （50 μL/h） 的"开始"按钮。
10. 停止图像捕获并关闭显微镜的荧光，以避免基材发生光漂白。
11. 重复步骤 5.8.-5.10。对于使用的每种测量流量。

结果

图 1:最终器件配置。（A） 将软管连接到相应输入和输出的亚克力装置。刻度以厘米为单位显示设备的尺寸。（B） 形成微粒捕集器的方案。当设备放置在垂直位置时，微粒在重力作用过通道。微粒在 5 μm 限制处浓缩。通过侧通道旋转芯片，很容易去除多余的微粒。芯片保持垂直，以便在免疫测定前保留捕获物。（C） 安装在倒置荧光显微镜载物台上包含磁体的载玻片上的微流体装置。观察用于添加试剂的分配针头，以及连接到注射泵的出口软管。

图 2:纳米颗粒分...

材料