基于磁性纳米颗粒的微流控芯片免疫分析法

摘要

来源：Hernández-Ortiz, J. A.，等。用于基于磁性纳米粒子免疫分析的阶梯式限流微流控丙烯酸装置的计算机数控微铣削。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种基于磁性纳米颗粒的免疫分析微流控系统。该检测系统采用了一种在其通道内集成磁性捕获结构的微流控装置。将预先形成的免疫复合物——由抗原包被的磁性纳米颗粒与一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗结合而成——引入通道中。在外加磁场作用下，免疫复合物被截留在多孔磁性捕获结构中。通过使用一种在过氧化物酶催化下可发出荧光的荧光底物，在显微镜下对被捕获的免疫复合物进行检测。

方案

1. 设备准备

1. 使用注射器将蒸馏水注入通道中，确保无泄漏或流动阻力。将装置浸入超声波清洗仪中10分钟，以去除通道内残留的丙烯酸、粘合剂或其他不需要的物质。
2. 排空装置通道内的水，使用注射器注入阻断溶液，该溶液由5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶于1×Tris缓冲盐水（TBS）中配制而成，并经0.2 µm聚醚砜（PES）注射器滤器预先过滤。
3. 在5% BSA溶液中制备直径为7.5 µm的铁微粒悬浮液。
   注意：微粒已预先修饰有二氧化硅-聚乙二醇（PEG）涂层，可抵抗蛋白质吸附。
4. 将芯片与微粒悬浮液在阻断溶液中于室温孵育至少1小时。如有可能，建议在4 °C下孵育过夜。

2. 微粒捕获结构的形成

1. 使用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。将芯片垂直放置，使微粒在重力作用下流经侧通道。分两步将芯片旋转180°，每次旋转90°，使微粒靶向并聚集在5 µm的狭窄处。
2. 将芯片向侧通道方向旋转45°，利用重力去除多余的微粒。
3. 保持装置直立，以避免破坏微粒捕获结构。微粒捕获形成过程的示意图参见图1B。

结果

图1：最终装置构型。 （A）丙烯酸材质的装置，其软管已连接至相应的输入和输出端口。标尺显示了装置的尺寸（单位：厘米）。（B）微粒捕获结构的形成流程。当装置处于垂直位置时，微粒在重力作用下流经通道，并在5 µm的狭窄区域被富集。通过侧通道旋转芯片可轻松去除多余的微粒。在进行免疫分析前，芯片保持垂直以维持捕获结构。（C）微流控装置安装于载有磁体的玻璃载玻片上，并置于倒置荧光显微镜载物台上。图中可见用于添加试剂的加样针，以及连接至注射泵的出口软管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羰基铁微粒	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
氯仿	Fermont	6201	健康危害：中等 可燃性：无 反应性：无 接触危害：中等
CMOS 相机 Moment	Teledyne Photometrics		传感器技术：CMOS 量子效率：73% 像素尺寸：4.5 µm x 4.5 µm 支持接口：USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave 软件	Roland DGA Corporation		用于在表面设计和生成雕刻路径的雕刻软件
通风橱	未知	未知
柔性塑料管	Tygon	AAD04103	内径 = 0.020，外径 = 0.060
荧光显微镜	ZEISS	Axio Vert.A1
高精度点胶针头	Loctite	98612
MagJET 分离架	thermoscientific		12 x 1.5 mL
聚甲基丙烯酸甲酯板材 - PMMA，亚克力	Goodfellow	ME303018/1	厚度：1.3 mm，透明度：透明
PVCamTest 软件	Teledyne Photometrics	版本 3.10.107	图像采集软件
体视显微镜	Nikon	SMZ 7457
SuperMag 羧基磁珠	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
注射泵	kd Scientific	KDS200	最多可容纳两个注射器
超声波清洗仪	Branson	2800
VPanel 软件	Windows OS	版本 1.0.3.0	用于控制微铣床的软件