基于磁性纳米颗粒的微流控芯片免疫分析法

摘要

来源：Hernández-Ortiz, J. A.，等。用于基于磁性纳米粒子免疫分析的阶梯式限流微流控丙烯酸装置的计算机数控微铣削。 J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种基于磁性纳米颗粒的免疫分析微流控系统。该检测系统采用了一种在其通道内集成磁性捕获结构的微流控装置。将预先形成的免疫复合物——由抗原包被的磁性纳米颗粒与一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗结合而成——引入通道中。在外加磁场作用下，免疫复合物被截留在多孔磁性捕获结构中。通过使用一种在过氧化物酶催化下可发出荧光的荧光底物，在显微镜下对被捕获的免疫复合物进行检测。

方案

1. 设备准备

1. 使用注射器将蒸馏水注入通道中，确保无泄漏或流动阻力。将装置浸入超声波清洗仪中10分钟，以去除通道内残留的丙烯酸、粘合剂或其他不需要的物质。
2. 排空装置通道内的水，使用注射器注入阻断溶液，该溶液由5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶于1×Tris缓冲盐水（TBS）中配制而成，并经0.2 µm聚醚砜（PES）注射器滤器预先过滤。
3. 在5% BSA溶液中制备直径为7.5 µm的铁微粒悬浮液。
   注意：微粒已预先修饰有二氧化硅-聚乙二醇（PEG）涂层，可抵抗蛋白质吸附。
4. 将芯片与微粒悬浮液在阻断溶液中于室温孵育至少1小时。如有可能，建议在4 °C下孵育过夜。

2. 微粒捕获结构的形成

1. 使用注射器针头通过侧通道出口软管将微粒插入芯片中。将芯片垂直放置，使微粒在重力作用下流经侧通道。分两步将芯片旋转180°，每次旋转90°，使微粒靶向并聚集在5 µm的狭窄处。
2. 将芯片向侧通道方向旋转45°，利用重力去除多余的微粒。
3. 保持装置直立，以避免破坏微粒捕获结构。微粒捕获形成过程的示意图参见图1B。

3. 免疫测定

1. 纳米颗粒制备
   1. 取 2 µL 已与溶菌酶（抗原模型）偶联的 100 nm 纳米颗粒悬浮液，加入 1.5 mL 微量离心管中，并加入 100 µL 封闭液。在 4 °C 下孵育过夜。
   2. 加入 150 µL 洗涤缓冲液（1× TBS，0.05% Tween 20）。
   3. 将 1.5 mL 微量离心管放入磁力分离器中。静置 15 分钟，使纳米颗粒分离（图 2）。
      注意：磁力分离器所需的最小体积为 200 µL。避免使用更小体积。
   4. 用移液器移除管中的液体。避免接触管壁上形成纳米颗粒沉淀的区域。
   5. 加入 250 µL 新鲜洗涤缓冲液。将离心管置于振荡条件下 15 分钟。
   6. 重复步骤 3.1.3–3.1.5 共 2 次，每次仅振荡 5 分钟。
   7. 加入所需浓度的一抗（抗溶菌酶抗体）（参见 材料表），用抗体稀释液（1× TBS，1% BSA，0.05% Tween 20）调节终体积至 100 µL。
   8. 在 37 °C 下孵育 15 分钟，随后在室温下继续振荡孵育 15 分钟。
   9. 重复洗涤步骤 3.1.2–3.1.6。
   10. 加入 100 µL 抗体稀释液，并按 1:500 稀释比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-AbII）（参见 材料表）。
   11. 重复洗涤步骤 3.1.2–3.1.6。
   12. 将纳米颗粒保存于终体积为 50 µL 的抗体稀释液中。

4. 实验安装

1. 将两个 100 µL 玻璃注射器注满水，将一根 6.5 cm 长的软管连接到每个注射器上，在软管末端插入金属针，并将两个注射器放置在计算机控制的注射泵上。
2. 用加热法密封丙烯酸装置的所有软管。
3. 切断入口软管，仅保留几毫米长度。用洗涤缓冲液填充分配针，并将其插入已切断的软管中。在将针连接至装置前，先让溶液滴出，以防止空气进入装置。
4. 切断侧通道的出口软管，连接至注射泵。接着，对主通道的出口软管执行相同操作。
   ​注意：必须按此顺序执行步骤 4.3–4.4，以避免微粒捕获结构松动。如有可能，在执行这些步骤时借助放大镜检查捕获结构的状态。
5. 将一块载玻片放置在显微镜载物台上。用双面胶带将磁铁固定在载玻片上，并在两侧各贴一小块胶带，以固定芯片边缘。
6. 在注射泵控制器的流速和单位选项卡中设置 50 µL/h 的流速。选择抽取模式，然后点击启动按钮，以启动洗涤缓冲液的流动。
7. 小心地以水平方向将装置移向带有磁铁的载玻片，使芯片上含有捕获结构的区域接触磁铁。
8. 用双面胶带将装置边缘粘贴在玻璃上，以防止移动。注意避免遮挡显微镜的光路（图 1C）。

5. 免疫检测

1. 以50 µL/h的流速持续用洗涤缓冲液冲洗10分钟，以去除多余的BSA。
2. 用移液器移除分配针中残留的洗涤缓冲液。加入50 µL纳米颗粒悬浮液。
3. 以100 µL/h的流速流经纳米颗粒悬浮液7分钟。随后，将流速调整为50 µL/h，继续流经15分钟。
4. 更换分配针。以50 µL/h的流速流加洗涤缓冲液10分钟。在洗涤过程中，根据制造商说明书配制荧光底物。
5. 用移液器从分配针中移除残留的洗涤缓冲液。加入100 µL荧光底物（参见 材料表。以 50 µL/h 的流速注入荧光底物，反应 6 分钟。
6. 设置 流速（1 µL/h，3 µL/h，5 µL/h，和 10 µL/h） 和 时间（6 分钟） 相应测量参数 流速 和 设置计时器 控制注射泵的界面选项卡。请务必选择 撤出 每次测量的模式。
7. 设置一个额外的 流速 标签位于 50 µL/h 和设置定时器 在 3 分钟 用于洗涤步骤。
8. 在底物以 50 µL/h 停止前 15 秒打开显微镜的荧光光源。在底物停止前 10 秒，使用显微镜相机软件开始图像采集，曝光时间为 1,000 毫秒。以每秒 1 帧（FPS）的速度连续成像 6 分钟。
9. 点击 开始 在底物洗涤以 50 µL/h 的流速停止后，立即点击所需流速参数的按钮。点击 开始 在选定的测量流停止后，立即按下清洗流（50 µL/h）的按钮。
10. 停止图像采集并关闭显微镜的荧光，以避免底物发生光漂白。
11. 对每个使用的测量流速重复步骤 5.8–5.10。

结果

图1：最终装置构型。 （A）丙烯酸材质的装置，其软管已连接至相应的输入和输出端口。标尺显示了装置的尺寸（单位：厘米）。（B）微粒捕获结构的形成流程。当装置处于垂直位置时，微粒在重力作用下流经通道，并在5 µm的狭窄区域被富集。通过侧通道旋转芯片可轻松去除多余的微粒。在进行免疫分析前，芯片保持垂直以维持捕获结构。（C）微流控装置安装于载有磁体的玻璃载玻片上，并置于倒置荧光显微镜载物台上。图中可见用于添加试剂的加样针，以及连接至注射泵的出口软管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羰基铁微粒	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
氯仿	Fermont	6201	健康危害：中等 可燃性：无 反应性：无 接触危害：中等
CMOS 相机 Moment	Teledyne Photometrics		传感器技术：CMOS 量子效率：73% 像素尺寸：4.5 µm x 4.5 µm 支持接口：USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave 软件	Roland DGA Corporation		用于在表面设计和生成雕刻路径的雕刻软件
通风橱	未知	未知
柔性塑料管	Tygon	AAD04103	内径 = 0.020，外径 = 0.060
荧光显微镜	ZEISS	Axio Vert.A1
高精度点胶针头	Loctite	98612
MagJET 分离架	thermoscientific		12 x 1.5 mL
聚甲基丙烯酸甲酯板材 - PMMA，亚克力	Goodfellow	ME303018/1	厚度：1.3 mm，透明度：透明
PVCamTest 软件	Teledyne Photometrics	版本 3.10.107	图像采集软件
体视显微镜	Nikon	SMZ 7457
SuperMag 羧基磁珠	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
注射泵	kd Scientific	KDS200	最多可容纳两个注射器
超声波清洗仪	Branson	2800
VPanel 软件	Windows OS	版本 1.0.3.0	用于控制微铣床的软件