一种基于免疫荧光的定量癌细胞复制应力的方法

Abstract

来源:Ramakrishnan， N. et al.， 使用单链 DNA 免疫荧光量化卵巢癌细胞中的复制应激。J. Vis. Exp. （2023 年）

该视频演示了一种基于免疫荧光的量化癌细胞复制应激的方法。羟基脲处理的细胞产生单链 DNA，通过免疫荧光检测。绿色荧光病灶的数量表示癌细胞中复制应激的水平。

Protocol

注意:这些步骤中使用了卵巢癌细胞系 OVCAR3，但该方案广泛适用于多种其他细胞系，包括来自非卵巢来源的细胞系。该协议的示意图如图 1 所示。

1. 电镀单元格

1. 制作聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。
   1. 将高压灭菌的 12 mm 直径盖玻片加入含聚-L-赖氨酸溶液的 50 mL 锥形管中，并放在摇杆上 15 分钟。
   2. 在组织培养罩中吸出溶液。加入无菌水清洗盖玻片，并将装有盖玻片的试管放回摇杆上 5 分钟。重复此洗涤步骤 3 次。
   3. 将涂有涂层的盖玻片铺在无菌培养皿上，吸出剩余的水。让盖玻片在组织培养罩中干燥 1 小时或直到没有水滴残留。干燥后，用封口膜密封培养皿，并置于 4 °C。
2. 将一个聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入 24 孔板的每个孔中。使用聚赖氨酸盖玻片对于防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上脱落至关重要。
3. 一旦 OVCAR3 细胞达到 70%-80% 汇合，就用胰蛋白酶消化。
   1. 要胰蛋白酶消化 70%-80% 汇合的 10 cm 培养皿，请从板中吸出培养基，并用 5-7 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤。
   2. 吸出 PBS，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，将培养皿置于 37 °C 培养箱中 8-10 分钟，或直到细胞从板底部脱落。
   3. 用 5-10 mL 培养基收集细胞，并加入锥形管中。
   4. 使用血细胞计数器使用标准程序手动计数细胞。
4. 稀释 25,000 个细胞/mL，并在放置在 24 孔板孔中的聚-L-赖氨酸盖玻片上添加 1 mL 细胞。对于任何其他细胞系，确定一个数字，使细胞在三次群体倍增后达到约 70%-80% 的汇合度。
5. 在标准条件下在培养基中培养细胞。

2. 使用 IdU 的脉冲单元

1. 为了使细胞正确扩散到盖玻片上，一个群体加倍就足够了。在一次群体倍增后，用 10 μM 5-碘-2'-脱氧尿嘧啶 （IdU） 脉冲细胞（参见有关如何重建 IdU 的材料表）进行两次后续群体倍增。
   注意:我们尝试了不同的胸苷类似物，包括溴脱氧尿嘧啶 （BrdU）、5-氯-2′-脱氧尿嘧啶 （CIdU） 和 IdU。在这三种类似物中，IdU 的信噪比最好。用三种不同类似物脉冲的细胞的比较图像如图 2 所示。我们建议使用两种阴性对照:（i） 无 IdU 脉冲样品，以及 （ii） 无一抗对照。如果由于给定的治疗而需要评估 ssDNA 的形成，我们建议在第一轮 IdU 加倍后添加药物。
2. 用 IdU 脉冲进行两次群体倍增后，收获细胞进行成像。
   1. 用冰冷的 0.5% PBSTx （PBS + 0.5% Triton X-100） 在冰上更换培养基 5 分钟。该预提取步骤有助于释放细胞质和非染色质结合的蛋白质，保持染色质结合的蛋白质完整。某些细胞系在预提取过程中很容易剥落。在这种情况下，可以使用 0.5% CSK 缓冲液（10 mM PIPES （pH 6.8）、100 mM 氯化钠 （NaCl）、300 mM 蔗糖、3 mM 氯化镁 （MgCl₂）、1 mM 乙二醇四乙酸 （EGTA） 和 0.5% Triton X-100）。

3. 注视

1. 吸出 PBSTx 并在室温下与 3% 多聚甲醛 （PFA）（材料表）孵育 15 分钟，然后用 1x PBS 洗涤 3 至 4 次。固定的细胞可以保持在 4 °C 直到进一步的步骤。
   注意:PFA 具有剧毒和致癌性。避免接触皮肤、眼睛和粘膜。在通风橱中使用 PFA 执行所有步骤，并正确处理材料。

4. 透化和封闭

1. 固定后，在冰上使用 0.5% PBSTx 透化细胞 5 分钟。使用足够的体积覆盖整个盖玻片（通常在 500 μL 和 1 mL 之间）。
2. 在室温下用 0.2% PBST（1X PBS + 0.2% Tween-20）洗涤细胞 3 至 4 次。1 mL PBST 足以清洗每个孔。背靠背进行洗涤，无需任何孵育。
3. 吸出 PBST 并使用 5% 牛血清白蛋白、在 1x PBS（封闭缓冲液）中制备的 BSA（材料表）在室温下封闭样品 30 分钟。

5. 使用 IdU 抗体进行免疫染色

1. 对于免疫染色，准备一个加湿室（平底特百惠上的湿纸巾）。用封口膜盖住 24 孔板的盖子，放入加湿室中，然后将盖玻片放在板盖上。
2. 通过在步骤 4.2 中的封闭缓冲液中以 1:200 的比例稀释来制备抗 BrdU 一抗小鼠一抗（材料表）。抗 BrdU 抗体先前已被证明可以检测 IdU。
3. 在盖玻片顶部添加 60 μL IdU 抗体稀释液。将盖玻片在 37 °C 下孵育 1 小时。
   1. 或者，如果将盖玻片翻转到一滴 （20-25 μL） 1:200 抗体稀释液上，移液到封口膜上，则使用较少的抗体溶液。这也降低了溶液在孵育过程中变干的可能性。
4. 孵育 1 小时后，吸出一抗。将盖玻片放回 24 孔板中，并用 0.2% PBST 洗涤四次。
5. 对于二抗，请使用步骤 5.1 中描述的相同加湿室。在封闭缓冲液 （1:200） 中稀释抗小鼠偶联的二抗（材料表）。向盖玻片中加入 60 μL 二抗，并在室温下避光孵育 1 小时。
6. 吸出二抗。将盖玻片放回 24 孔板中，用 0.2% PBST 洗涤四次。
7. 标记显微镜载玻片，并用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 封固剂将盖玻片安装在载玻片上（材料表）。将载玻片在室温下避光保存 24 小时。如果封固剂需要固化或硬化，建议孵育 24 小时。
   注意:然后将载玻片储存在 4 °C 下，然后在荧光显微镜上成像。图 3 显示了一个具有代表性的图像。

Results

图 1:IdU 标记示意图。用 IdU 脉冲细胞进行两次群体倍增。如果需要任何药物治疗，应在 IdU 存在下第一个群体翻倍后给药。

图 2:使用 IdU、BrdU 或 CldU 脉冲后获得的焦点信号比较。用三种不同的胸苷类似物脉冲的细胞的代表性图像。显示了 DAPI、GFP（代表 Alexa-488 标记的 IdU 焦点）和合并的通道。比例尺:10 μm。

Materials