一种基于免疫荧光的癌症细胞复制应激定量方法

摘要

来源：Ramakrishnan, N. 等，利用单链DNA免疫荧光定量卵巢癌细胞中的复制应激。J. Vis. Exp. (2023)

该视频展示了一种基于免疫荧光的方法，用于定量癌细胞中的复制应激。经羟基脲处理的细胞会产生单链DNA，可通过免疫荧光检测。绿色荧光焦点的数量反映了癌细胞中复制应激的水平。

方案

注意：这些步骤中使用了卵巢癌细胞系 OVCAR3，但本方案广泛适用于多种其他细胞系，包括来源于非卵巢组织的细胞系。图1展示了该方案的示意图。

1. 细胞接种

1. 制备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。
   1. 将经高压灭菌的直径为12 mm的盖玻片加入含有多聚-L-赖氨酸溶液的50 mL圆锥形离心管中，在摇床上孵育15分钟。
   2. 在细胞培养超净台中吸除溶液，加入无菌水清洗盖玻片，并将装有盖玻片的离心管放回摇床上继续孵育5分钟。重复此清洗步骤共三次。
   3. 将包被好的盖玻片平铺于无菌培养皿中，吸除残留水分，在细胞培养超净台中晾干1小时，或直至无可见水滴。干燥后用封口膜密封培养皿，并置于4 °C保存。
2. 将一片多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入24孔板的每个孔中。使用多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片至关重要，可防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上脱落。
3. 当OVCAR3细胞生长至70%–80%汇合度时，进行胰酶消化。
   1. 对于一个70%–80%汇合的10 cm培养皿，先吸除培养基，用5–7 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
   2. 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰酶溶液，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育8–10分钟，或直至细胞从培养皿底部脱落。
   3. 用5–10 mL培养基重悬细胞，并转移至离心管中。
   4. 按照标准操作流程，使用血细胞计数板手动计数细胞。
4. 将细胞稀释至25,000 个/mL，每孔加入1 mL细胞悬液至置于24孔板各孔中的多聚-L-赖氨酸包被盖玻片上。对于其他任何细胞系，应确定合适的接种数量，以确保细胞在经历三次群体倍增后达到约70%–80%的汇合度。
5. 在标准培养条件下，于培养基中继续培养细胞。

2. 用IdU脉冲处理细胞

1. 为使细胞在盖玻片上充分铺展，一次群体倍增即可。在一次群体倍增后，用 10 µM 5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）（IdU 的重构方法见材料表）对细胞进行脉冲标记，并持续两个后续的群体倍增周期。
   注意：我们已尝试了多种胸苷类似物，包括溴脱氧尿苷（BrdU）、5-氯-2′-脱氧尿苷（CIdU）和 IdU。在三种类似物中，IdU 具有最佳的信噪比。使用三种不同类似物进行脉冲标记的细胞的对比图像见图2。我们建议使用两种阴性对照：（i）未进行 IdU 脉冲标记的样本；（ii）无一抗对照。若需评估特定处理引起的单链 DNA（ssDNA）形成，建议在第一轮 IdU 倍增后添加药物。
2. 在用 IdU 脉冲标记两个群体倍增周期后，收集细胞用于成像。
   1. 将培养基替换为预冷的含 0.5% Triton X-100 的 PBS（即 0.5% PBSTx），冰上孵育 5 分钟。此预提取步骤有助于释放胞质和非染色质结合的蛋白质，同时保留染色质结合的蛋白质。某些细胞系在预提取过程中容易脱落。在此情况下，可使用 0.5% CSK 缓冲液（10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM 氯化钠（NaCl）、300 mM 蔗糖、3 mM 氯化镁（MgCl₂）、1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）和 0.5% Triton X-100）。

3. 固定

1. 吸弃 PBSTx，于室温下用 3% 多聚甲醛（PFA）（材料表）固定 15 分钟，随后用 1× PBS 洗涤三至四次。固定后的细胞可于 4 °C 保存，待后续操作。
   ​注意：PFA 具有高毒性且为致癌物。避免接触皮肤、眼睛和黏膜。所有涉及 PFA 的操作均应在通风橱中进行，并妥善处理废弃物。

4. 透化与封闭

1. 固定后，在冰上用 0.5% PBSTx 对细胞进行透化处理，持续 5 分钟。使用足够体积以完全覆盖盖玻片（通常为 500 µL 至 1 mL）。
2. 用 0.2% PBST（1× PBS + 0.2% Tween-20）在室温下洗涤细胞三到四次。每次洗涤每个孔使用 1 mL PBST 即可。连续进行洗涤，中间不进行任何孵育。
3. 吸除 PBST，并在室温下用含 5% 牛血清白蛋白 BSA（材料表）的 1× PBS（封闭缓冲液）封闭样本 30 分钟。

5. 使用IdU抗体进行免疫染色

1. 进行免疫染色时，准备一个加湿染色盒（在平底塑料盒内放置湿润的纸巾）。用封口膜覆盖24孔板的盖子，将其放入加湿染色盒中，并将盖玻片平铺在孔板盖子上。
2. 将抗BrdU小鼠一抗（材料表）用步骤4.2中的封闭缓冲液按1:200比例稀释。已有研究证实该抗BrdU抗体可识别IdU。
3. 在盖玻片表面加入60 µL的IdU抗体稀释液，在37 °C孵育1小时。
   1. 或者，可将盖玻片倒置在封口膜上预先滴加的抗体稀释液液滴（20–25 µL，1:200稀释）上，以减少抗体溶液用量。此方法也可降低孵育过程中溶液干燥的风险。
4. 孵育1小时后，吸除一抗溶液。将盖玻片放回24孔板中，用0.2% PBST洗涤四次。
5. 对于二抗孵育，使用步骤5.1中所述的同一加湿染色盒。将偶联的抗小鼠二抗（材料表）用封闭缓冲液按1:200稀释。在每张盖玻片上加入60 µL二抗稀释液，在室温避光条件下孵育1小时。该二抗对光敏感。
6. 吸除二抗溶液，将盖玻片放回24孔板中，用0.2% PBST洗涤四次。
7. 标记载玻片，并用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂（材料表）将盖玻片封固于载玻片上。将载玻片置于室温避光环境中静置24小时。若封片剂需要固化或硬化，建议孵育24小时。
   注意：封片后可将载玻片于4 °C保存，待后续在荧光显微镜下成像。代表性图像见图3。

结果

图1：IdU标记示意图。 细胞经IdU脉冲标记两个群体倍增周期。若需进行药物处理，应在第一个群体倍增周期后、IdU存在的情况下给予药物。

图2：使用IdU、BrdU或CldU脉冲标记后获...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 多聚甲醛（PFA）	Fisher Scientific	NC0179595	10 g 蔗糖 + 100 mL 10X PBS + 加水至总体积为 925 mL。加入 75 mL 40% 无甲醇 PFA，混匀，分装为每份 50 mL 后储存 储存条件：-20 °C 保存
5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）	Sigma Aldrich	I7125-5G	分子量 = 354.10 g/mol。配制 10 mM 储存液：将 3.541 mg IdU 溶解于 1 mL 1 N 液氨中
抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	347580	储存条件：4 °C 保存
山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 488 二抗	Thermo Scientific	A32766	避光保存——需置于暗处
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A7906-100G	将特定质量的 BSA 溶解于一定体积的 PBS 中配制 储存条件：4 °C 保存
圆形盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	培养基：RPMI 培养基，添加 L-谷氨酰胺、0.01 mg/mL 牛胰岛素、胎牛血清至终浓度 20%，以及 1X 青霉素-链霉素 储存条件：冻存液为完全培养基 + 5% DMSO，-80 °C 保存
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma Aldrich	P4832-50ML	储存条件：4 °C 保存
含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Scientific	P36962	储存条件：4 °C 保存
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Genesee Scientific	25-510	储存条件：4 °C 保存
无菌过滤水	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	储存条件：4 °C 保存