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一种用于无交叉反应多重夹心免疫测定的Snap Chip技术

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2025年7月8日

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摘要

来源:Li, H. 用于无交叉反应和无需点样仪的多重夹心免疫测定的 Snap Chip 技术J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了用于无交叉反应的多重夹心免疫测定的 snap chip 技术。通过将两张分别含有不同试剂的微阵列玻片简单扣合,即可实现试剂转移而无交叉污染,从而利用夹心免疫测定法检测多种蛋白质。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 快速芯片的制备与储存

  1. 单次转移法(图1a
    1. 使用喷墨微阵列点样仪,在相对湿度为60%的条件下,将含有400 µg/mL抗体和20%甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)中的cAb溶液以每点1.2 nL的体积点样到硝酸纤维素膜(或功能化玻璃)检测芯片上,点间中心距为800 µm。确保芯片按照某一角落(此处使用左下角)固定在点样仪载物台上。
    2. 将点样后的检测芯片在室温、相对湿度60%条件下孵育1小时。
    3. 将带有16个腔室的芯片模块垫片夹紧在检测芯片上,将其分为16个孔。每个孔中加入含0.1% Tween-20的PBS(PBST)80 µL,在摇床上以450 rpm振荡清洗3次,每次5分钟。
    4. 向每个孔中加入80 µL封闭液,在450 rpm下振荡孵育1小时。
    5. 移除垫片,并用氮气流吹干检测芯片。
    6. 将一张转移芯片固定在点样仪载物台上,使其左下角紧贴点样仪载物台的左下角。使用喷墨点样仪点样一组与捕获抗体(cAbs)布局相同的对齐标记(聚苯乙烯微球溶液)。
    7. 让对齐标记自然干燥。翻转转移芯片并重新放回点样仪载物台,仍以左下角对齐固定。
    8. 配制检测抗体(dAb)点样溶液,其中含20 µg/mL抗体、20%甘油和1%牛血清白蛋白(BSA)。
    9. 使用点样仪的摄像头拍摄一个对齐标记图像,并将该图像作为基准点导入点样程序,使喷墨点样仪的图像识别系统能够识别左上角标记。以其坐标作为dAb阵列的第一个点位,每液滴点样8 nL,点间中心距为800 µm。
  2. 双次转移法(图1b
    1. 将转移芯片1放置在喷墨点样仪载物台上,使其紧贴左下角。使用喷墨微阵列点样仪在相对湿度60%条件下,将含有400 µg/mL抗体、20%甘油和1% BSA的PBS中的cAb溶液点样到芯片上(每点0.4 nL,直径约200 µm),点间中心距为400 µm。
    2. 使用压接装置(图2)将转移芯片与涂覆硝酸纤维素膜(或功能化玻璃)的检测芯片压接,以将cAb液滴转移至检测芯片。
      1. 将压接装置侧面的六个旋钮均旋转90度,以拉出并锁定所有活塞处于开启位置。将转移芯片插入其卡槽中的载片夹内,确保切角朝向固定的弹簧探针。旋转第一组三个旋钮,释放带金色弹簧探针的活塞,并确保芯片被推紧至对齐销钉。
      2. 将一张涂覆硝酸纤维素膜的芯片倒置放置在压接装置的4个弹簧探针上。旋转第二组三个旋钮,释放带银色弹簧探针的活塞,并确保芯片被推紧至对齐销钉。
      3. 利用对齐柱和对齐孔将上壳体准确对位后盖上,关闭压接装置。
      4. 将闭合的压接装置插入其外壳中,并将闭锁标签完全下压,使两个微阵列面对面接触并施加适当压力。保持闭合状态1分钟。
    3. 分离两片芯片。将检测芯片在室温、相对湿度60%条件下孵育1小时。按照步骤1.1.3至1.1.5所述进行洗涤、封闭和干燥。
    4. 将另一张转移芯片放置在喷墨点样仪载物台上,并紧贴左下角。点样含有50或100 µg/mL抗体(见表1)、20%甘油和1% BSA的PBS中的dAb溶液。确保每点体积为0.8 nL,点间中心距为400 µm。
    5. 储存检测芯片和转移芯片。将检测芯片和转移芯片分别密封于含干燥剂的密闭袋中,并置于-20 °C冰箱中保存。

2. 使用快照芯片进行多重免疫测定

  1. 从冷冻柜中取出检测玻片。将袋子保持密封状态30分钟,直至玻片恢复至室温。
  2. 用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液对蛋白质进行7点倍比稀释,配制样品溶液。
    注意:此处使用5倍稀释因子。各蛋白质的起始浓度见表1。
  3. 根据需要配制样品溶液。例如,将人血清用PBST缓冲液稀释4倍。
  4. 将一个16孔密封垫固定在检测玻片上。
  5. 用移液器向同一列的8个孔中加入7种蛋白质稀释液和1种不含蛋白质的PBST缓冲液。在同一玻片的另外8个孔中加入其他样品溶液。
    注意:每个孔可容纳80 µL溶液。必要时可使用更多玻片以检测额外样品。
  6. 将样品置于摇床中,450 rpm振荡孵育,可在室温下孵育1小时,或在4 °C过夜。随后在摇床上用PBST缓冲液洗涤玻片3次,每次5分钟。取下密封垫,并用氮气流吹干玻片。
  7. 从冷冻柜中取出带有dAbs的转移玻片。保持袋子密封,在室温下静置30分钟。然后将玻片放入密闭容器(例如空枪头盒)中,该容器内含有60%湿度稳定珠,孵育20分钟以完成再水合。
  8. 使用卡扣装置(图2)将转移玻片与检测玻片压合,以实现dAb液滴的转移。卡扣装置的操作详见第1.2.2节。
  9. 分离两片玻片。将检测玻片放入含有60%湿度稳定珠的密闭容器中孵育1小时。用16孔密封垫固定检测玻片,并在摇床上以450 rpm用PBST缓冲液清洗4次,每次5分钟。
  10. 向每个孔中加入80 µL含有2.5 µg/mL链霉亲和素荧光染料的PBS溶液。在摇床上450 rpm振荡孵育20分钟。
  11. 在摇床上以450 rpm依次用PBST缓冲液洗涤玻片3次,再用蒸馏水洗涤1次,每次5分钟。取下密封垫,并用氮气吹干玻片。

3. 载玻片扫描与数据分析

  1. 使用635 nm激光的荧光微阵列扫描仪扫描检测芯片。
  2. 使用分析软件(例如array-pro analyzer)提取每个点的净信号强度。
  3. 使用统计学软件计算每种蛋白质的检测限(LOD),并确定样品中蛋白质的浓度。
    注意:检测限(LOD)定义为标准曲线的Y轴截距加上三次独立检测结果标准差的三倍。

表1. 50重检测在缓冲液中的蛋白浓度及检出限。CA 15-3的检出限单位为U/ml(*)。

蛋白名称起始浓度 (ng/ml)检测下限 (pg/ml)蛋白名称起始浓度 (ng/ml)检测下限 (pg/ml)
ANG25001.3 × 104IL-6b12.1 × 102
BDNF5001.0 × 102IL-55077
CA 15-3*14.9 × 103IL-410001.5 × 104
CEA10005.4 × 103IL-25076
CXCL10/IP-10501.7 × 102LEP2004.0 × 102
CRP20044MIG50011 × 102
ENG10006.2 × 102CCL3/MIP-1α503.3
EGF501.8 × 102CCL4/MIP-1β5012
EGFR2001.9 × 102MMP-35001.0 × 102
FAS-L5004.5 × 102M-CSF5008.2 × 103
FGF5001.0 × 103MMP-92003.1 × 102
G-CSF50039CCL2/MCP-15055
GM-CSF503.8NCAM-15001.7 × 103
GRO-α503.0 × 102β-NGF2001.4 × 103
HER25003.5 × 103NT-32005.8 × 102
PDGF-BB20073OPN5001.9 × 103
IL-1β5007.9 × 102RBP42001.2 ×102
IL-1ra2001.1 × 103SPARC10004.6 ×104
IL-15508.2 × 102TNF-α504.4
IL-12130TNF-RI501.3 × 102
IL-115001.2 × 103TNF-RII5012
IL-105006.1 ×102FAS/TNFRSF62002.8 ×102
IL-8506.6uPA20024
IL-72.526uPAR(CD87)20076
IL-6a100084VEGF2006.7 × 102

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结果

微阵列抗体检测示意图:捕获、检测、孵育抗体、荧光扫描。
图1. 检测流程示意图,比较(a)单次转移与(b)双次转移方法。

单次与双次转移示意图;抗体检测芯片流程中突出显示了转移机制。
图 2. 单次与双次转移差异的示意图。 (a) 转移试剂的镜像效应放大了芯片与喷墨XY平台之间的角度偏差。(b) 双次转移方法克服了角度偏差问题。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液片剂Fisher Scientific5246501EA
链霉亲和素偶联Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
牛血清白蛋白Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
甘油Sigma-AldrichG5516
封闭液:不含BSA的StabilGuard Choice微阵列稳定剂SurModics, IncSG02
硝酸纤维素包被载玻片Grace Bio-Laboratories, Inc305116
氨基硅烷包被载玻片Schott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
喷墨微阵列点样仪GeSiMNanoplotter 2.0
载玻片模块垫圈Grace Bio-Laboratories, Inc204862
湿度稳定珠Parallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer软件Media CyberneticsVersion 4.5
荧光微阵列扫描仪AgilentSureScan Microarray Scanner
生物统计学软件GraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
内皮糖蛋白捕获抗体R&D SystemsMAB10972
内皮糖蛋白蛋白R&D Systems1097-EN
内皮糖蛋白检测抗体R&D SystemsBAF1097
IL-6a(见表1)R&D Systems
IL-6b(见表1)Invitrogen

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