一种用于无交叉反应多重夹心免疫测定的Snap Chip技术

摘要

来源：Li, H. 等，用于无交叉反应和无需点样仪的多重夹心免疫测定的 Snap Chip 技术。J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了用于无交叉反应的多重夹心免疫测定的 snap chip 技术。通过将两张分别含有不同试剂的微阵列玻片简单扣合，即可实现试剂转移而无交叉污染，从而利用夹心免疫测定法检测多种蛋白质。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 快速芯片的制备与储存

1. 单次转移法（图1a）
   1. 使用喷墨微阵列点样仪，在相对湿度为60%的条件下，将含有400 µg/mL抗体和20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中的cAb溶液以每点1.2 nL的体积点样到硝酸纤维素膜（或功能化玻璃）检测芯片上，点间中心距为800 µm。确保芯片按照某一角落（此处使用左下角）固定在点样仪载物台上。
   2. 将点样后的检测芯片在室温、相对湿度60%条件下孵育1小时。
   3. 将带有16个腔室的芯片模块垫片夹紧在检测芯片上，将其分为16个孔。每个孔中加入含0.1% Tween-20的PBS（PBST）80 µL，在摇床上以450 rpm振荡清洗3次，每次5分钟。
   4. 向每个孔中加入80 µL封闭液，在450 rpm下振荡孵育1小时。
   5. 移除垫片，并用氮气流吹干检测芯片。
   6. 将一张转移芯片固定在点样仪载物台上，使其左下角紧贴点样仪载物台的左下角。使用喷墨点样仪点样一组与捕获抗体（cAbs）布局相同的对齐标记（聚苯乙烯微球溶液）。
   7. 让对齐标记自然干燥。翻转转移芯片并重新放回点样仪载物台，仍以左下角对齐固定。
   8. 配制检测抗体（dAb）点样溶液，其中含20 µ....

结果

图1. 检测流程示意图，比较（a）单次转移与（b）双次转移方法。

图 2. 单次与双次转移差异的示意图。 (a) 转移试剂的镜像效应放大了芯片与喷墨XY平台之间的角度偏差。(b) 双次转移方法克服了角度偏差问题。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液片剂	Fisher Scientific	5246501EA
链霉亲和素偶联Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
牛血清白蛋白	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
封闭液：不含BSA的StabilGuard Choice微阵列稳定剂	SurModics, Inc	SG02
硝酸纤维素包被载玻片	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
氨基硅烷包被载玻片	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
喷墨微阵列点样仪	GeSiM	Nanoplotter 2.0
载玻片模块垫圈	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
湿度稳定珠	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer软件	Media Cybernetics	Version 4.5
荧光微阵列扫描仪	Agilent	SureScan Microarray Scanner
生物统计学软件	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
内皮糖蛋白捕获抗体	R&D Systems	MAB10972
内皮糖蛋白蛋白	R&D Systems	1097-EN
内皮糖蛋白检测抗体	R&D Systems	BAF1097
IL-6a（见表1）	R&D Systems
IL-6b（见表1）	Invitrogen