一种用于无交叉反应多重夹心免疫测定的Snap Chip技术

摘要

来源：Li, H. 等，用于无交叉反应和无需点样仪的多重夹心免疫测定的 Snap Chip 技术。J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了用于无交叉反应的多重夹心免疫测定的 snap chip 技术。通过将两张分别含有不同试剂的微阵列玻片简单扣合，即可实现试剂转移而无交叉污染，从而利用夹心免疫测定法检测多种蛋白质。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 快速芯片的制备与储存

1. 单次转移法（图1a）
   1. 使用喷墨微阵列点样仪，在相对湿度为60%的条件下，将含有400 µg/mL抗体和20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中的cAb溶液以每点1.2 nL的体积点样到硝酸纤维素膜（或功能化玻璃）检测芯片上，点间中心距为800 µm。确保芯片按照某一角落（此处使用左下角）固定在点样仪载物台上。
   2. 将点样后的检测芯片在室温、相对湿度60%条件下孵育1小时。
   3. 将带有16个腔室的芯片模块垫片夹紧在检测芯片上，将其分为16个孔。每个孔中加入含0.1% Tween-20的PBS（PBST）80 µL，在摇床上以450 rpm振荡清洗3次，每次5分钟。
   4. 向每个孔中加入80 µL封闭液，在450 rpm下振荡孵育1小时。
   5. 移除垫片，并用氮气流吹干检测芯片。
   6. 将一张转移芯片固定在点样仪载物台上，使其左下角紧贴点样仪载物台的左下角。使用喷墨点样仪点样一组与捕获抗体（cAbs）布局相同的对齐标记（聚苯乙烯微球溶液）。
   7. 让对齐标记自然干燥。翻转转移芯片并重新放回点样仪载物台，仍以左下角对齐固定。
   8. 配制检测抗体（dAb）点样溶液，其中含20 µg/mL抗体、20%甘油和1%牛血清白蛋白（BSA）。
   9. 使用点样仪的摄像头拍摄一个对齐标记图像，并将该图像作为基准点导入点样程序，使喷墨点样仪的图像识别系统能够识别左上角标记。以其坐标作为dAb阵列的第一个点位，每液滴点样8 nL，点间中心距为800 µm。
2. 双次转移法（图1b）
   1. 将转移芯片1放置在喷墨点样仪载物台上，使其紧贴左下角。使用喷墨微阵列点样仪在相对湿度60%条件下，将含有400 µg/mL抗体、20%甘油和1% BSA的PBS中的cAb溶液点样到芯片上（每点0.4 nL，直径约200 µm），点间中心距为400 µm。
   2. 使用压接装置（图2）将转移芯片与涂覆硝酸纤维素膜（或功能化玻璃）的检测芯片压接，以将cAb液滴转移至检测芯片。
      1. 将压接装置侧面的六个旋钮均旋转90度，以拉出并锁定所有活塞处于开启位置。将转移芯片插入其卡槽中的载片夹内，确保切角朝向固定的弹簧探针。旋转第一组三个旋钮，释放带金色弹簧探针的活塞，并确保芯片被推紧至对齐销钉。
      2. 将一张涂覆硝酸纤维素膜的芯片倒置放置在压接装置的4个弹簧探针上。旋转第二组三个旋钮，释放带银色弹簧探针的活塞，并确保芯片被推紧至对齐销钉。
      3. 利用对齐柱和对齐孔将上壳体准确对位后盖上，关闭压接装置。
      4. 将闭合的压接装置插入其外壳中，并将闭锁标签完全下压，使两个微阵列面对面接触并施加适当压力。保持闭合状态1分钟。
   3. 分离两片芯片。将检测芯片在室温、相对湿度60%条件下孵育1小时。按照步骤1.1.3至1.1.5所述进行洗涤、封闭和干燥。
   4. 将另一张转移芯片放置在喷墨点样仪载物台上，并紧贴左下角。点样含有50或100 µg/mL抗体（见表1）、20%甘油和1% BSA的PBS中的dAb溶液。确保每点体积为0.8 nL，点间中心距为400 µm。
   5. 储存检测芯片和转移芯片。将检测芯片和转移芯片分别密封于含干燥剂的密闭袋中，并置于-20 °C冰箱中保存。

2. 使用快照芯片进行多重免疫测定

1. 从冷冻柜中取出检测玻片。将袋子保持密封状态30分钟，直至玻片恢复至室温。
2. 用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液对蛋白质进行7点倍比稀释，配制样品溶液。
   注意：此处使用5倍稀释因子。各蛋白质的起始浓度见表1。
3. 根据需要配制样品溶液。例如，将人血清用PBST缓冲液稀释4倍。
4. 将一个16孔密封垫固定在检测玻片上。
5. 用移液器向同一列的8个孔中加入7种蛋白质稀释液和1种不含蛋白质的PBST缓冲液。在同一玻片的另外8个孔中加入其他样品溶液。
   注意：每个孔可容纳80 µL溶液。必要时可使用更多玻片以检测额外样品。
6. 将样品置于摇床中，450 rpm振荡孵育，可在室温下孵育1小时，或在4 °C过夜。随后在摇床上用PBST缓冲液洗涤玻片3次，每次5分钟。取下密封垫，并用氮气流吹干玻片。
7. 从冷冻柜中取出带有dAbs的转移玻片。保持袋子密封，在室温下静置30分钟。然后将玻片放入密闭容器（例如空枪头盒）中，该容器内含有60%湿度稳定珠，孵育20分钟以完成再水合。
8. 使用卡扣装置（图2）将转移玻片与检测玻片压合，以实现dAb液滴的转移。卡扣装置的操作详见第1.2.2节。
9. 分离两片玻片。将检测玻片放入含有60%湿度稳定珠的密闭容器中孵育1小时。用16孔密封垫固定检测玻片，并在摇床上以450 rpm用PBST缓冲液清洗4次，每次5分钟。
10. 向每个孔中加入80 µL含有2.5 µg/mL链霉亲和素荧光染料的PBS溶液。在摇床上450 rpm振荡孵育20分钟。
11. 在摇床上以450 rpm依次用PBST缓冲液洗涤玻片3次，再用蒸馏水洗涤1次，每次5分钟。取下密封垫，并用氮气吹干玻片。

3. 载玻片扫描与数据分析

1. 使用635 nm激光的荧光微阵列扫描仪扫描检测芯片。
2. 使用分析软件（例如array-pro analyzer）提取每个点的净信号强度。
3. 使用统计学软件计算每种蛋白质的检测限（LOD），并确定样品中蛋白质的浓度。
   注意：检测限（LOD）定义为标准曲线的Y轴截距加上三次独立检测结果标准差的三倍。

表1. 50重检测在缓冲液中的蛋白浓度及检出限。CA 15-3的检出限单位为U/ml（*）。

蛋白名称	起始浓度 (ng/ml)	检测下限 (pg/ml)	蛋白名称	起始浓度 (ng/ml)	检测下限 (pg/ml)
ANG2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
BDNF	500	1.0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
CEA	1000	5.4 × 103	IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	LEP	200	4.0 × 102
CRP	200	44	MIG	500	11 × 102
ENG	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
EGF	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSF	500	8.2 × 103
FGF	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
GRO-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ra	200	1.1 × 103	SPARC	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RII	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
IL-8	50	6.6	uPA	200	24
IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6a	1000	84	VEGF	200	6.7 × 102

结果

图1. 检测流程示意图，比较（a）单次转移与（b）双次转移方法。

图 2. 单次与双次转移差异的示意图。 (a) 转移试剂的镜像效应放大了芯片与喷墨XY平台之间的角度偏差。(b) 双次转移方法克服了角度偏差问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液片剂	Fisher Scientific	5246501EA
链霉亲和素偶联Cy5	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
牛血清白蛋白	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
封闭液：不含BSA的StabilGuard Choice微阵列稳定剂	SurModics, Inc	SG02
硝酸纤维素包被载玻片	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
氨基硅烷包被载玻片	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
喷墨微阵列点样仪	GeSiM	Nanoplotter 2.0
载玻片模块垫圈	Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
湿度稳定珠	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer软件	Media Cybernetics	Version 4.5
荧光微阵列扫描仪	Agilent	SureScan Microarray Scanner
生物统计学软件	GraphPad Software	GraphPad Prism 6
内皮糖蛋白捕获抗体	R&D Systems	MAB10972
内皮糖蛋白蛋白	R&D Systems	1097-EN
内皮糖蛋白检测抗体	R&D Systems	BAF1097
IL-6a（见表1）	R&D Systems
IL-6b（见表1）	Invitrogen