使用来自相同宿主物种的一抗的多重免疫染色方法

Abstract

来源:Lyu， Q. 等人。 微波和荧光团-酪胺用于小鼠肾上腺的多重免疫染色 - 使用来自相同宿主物种的未偶联一抗。J. Vis. Exp. （2020 年）。

该视频演示了使用来自相同宿主物种的一抗进行多重免疫染色的检测方法。在这种方法中，肾上腺组织切片经历两步免疫染色过程。最初，用对皮质中标志物具有特异性的抗体对切片进行染色，然后剥离结合的抗体并用对髓质中标志物具有特异性的抗体重新染色。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 使用第一抗体染色

1. 对福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 载玻片进行脱蜡和水化，分配 5 分钟分配给以下每个步骤:二甲苯或等效试剂 3x、100% 乙醇 2x、95% 乙醇 1x、70% 乙醇 1x、50% 乙醇 1x 和蒸馏水 2x.
   注意:从此再水化步骤开始，玻片应保持湿润，直到最后一步安装。
2. 对于可选的抗原修复，将玻片置于 275 mL 沸腾的柠檬酸钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中 8 分钟。为了保持溶液沸腾，将载玻片平放在带盖的 14 x 9.5 x 9 cm³（宽 x 长 x 高）移液器吸头盒的底部，并在 700 W 微波炉中以 70% 的功率微波加热溶液 8 分钟。然后从微波炉中取出移液器吸头盒，打开盖子，让溶液在室温 （RT） 下冷却至少 20 分钟。
3. 将载玻片转移到含有 PBST（含 0.1% 聚山梨酯 20/80 的磷酸盐缓冲盐水）的 Coplin 染色缸中。用 PBST 洗涤 5 分钟 3 次。如果不立即进行下一步，请将此步骤中的载玻片与 PBST 一起储存在 Coplin 染色缸中，在 RT 或 4 °C 下保存 1-2 天（如果不立即进行下一步）。
4. 要制备封闭液，请使用二抗宿主物种的正常血清作为封....

Materials