使用同一种宿主来源的一抗进行多重免疫染色的方法

摘要

来源：Lyu, Q., 等. 利用微波与荧光素-酪胺信号放大技术在小鼠肾上腺组织上实现多重免疫染色——使用同一宿主物种来源的未标记一抗. 可视实验杂志 (2020).

本视频展示了一种使用同一宿主物种来源的一抗进行多重免疫染色的实验方法。该方法中，肾上腺组织切片经历两步免疫染色过程：首先，切片用特异性识别皮质标记物的抗体进行染色；随后，去除已结合的抗体，再用特异性识别髓质标记物的抗体重新染色。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 第一种抗体染色

1. 使用二甲苯或等效试剂脱蜡并复水甲醛固定石蜡包埋（FFPE）切片，以下每一步各持续5分钟：二甲苯或等效试剂3次，100%乙醇2次，95%乙醇1次，70%乙醇1次，50%乙醇1次，蒸馏水2次。
   注意：从本复水步骤开始，切片应始终保持湿润，直至最终封片步骤。
2. 如需进行抗原修复，将切片置于275 mL煮沸的柠檬酸钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中8分钟。为保持溶液沸腾，将切片平放于一个14 × 9.5 × 9 cm³（宽×长×高）带盖的移液枪头盒底部，放入700 W微波炉中以70%功率微波加热8分钟。随后将移液枪头盒从微波炉中取出，打开盖子，让溶液在室温（RT）下冷却至少20分钟。
3. 将切片转移至含有PBST（含0.1%吐温20/80的磷酸盐缓冲液）的考普林瓶中，用PBST洗涤5分钟，重复3次。若不立即进行下一步操作，可将切片在此步骤中用PBST在考普林瓶中于室温下保存数小时，或于4 °C保存1-2天。
4. 配制封闭液时，使用与二抗宿主物种相同的正常血清作为封闭试剂。也可使用其他市售封闭试剂。若使用本研究中所用的正常血清，则将100 µL正常驴血清加入4.9 mL PBST中。封闭液可在4 °C下保存最多3天。
5. 封闭时，轻轻甩去切片上的PBST，并迅速用足量封闭液覆盖切片。将切片置于湿盒中，室温孵育30分钟。
6. 用封闭液稀释一抗至所需浓度，配制一抗溶液（两片切片使用500 µL）。溶液在使用前应置于冰上保存。
   1. 针对3β-羟基类固醇脱氢酶（3βHSD），将2 µL 3βHSD抗体加入498 µL封闭液中。
   2. 针对酪氨酸羟化酶（TH），将0.5 µL TH抗体加入499 µL封闭液中。
   3. 针对β-连环蛋白（β-catenin），将1 µL β-catenin抗体加入499 µL封闭液中。
   4. 针对20α-羟基类固醇脱氢酶（20αHSD），将1 µL 20αHSD抗体加入499 µL封闭液中。
   5. 针对细胞色素P450 2F2（CYP2F2），将2 µL CYP2F2抗体加入498 µL封闭液中。
7. 孵育一抗时，轻轻甩去切片上的封闭液，并迅速用足量一抗溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，4 °C过夜孵育。孵育期间可用一小片石蜡膜覆盖切片以防止干燥。
8. 次日早晨，用PBST洗涤切片5分钟，重复3次。
9. 用封闭液稀释生物素标记的二抗至所需浓度，配制二抗溶液（两片切片使用500 µL）（例如，将1 µL驴抗小鼠抗体或驴抗兔抗体加入499 µL封闭液中）。溶液在使用前应置于冰上保存。
10. 孵育二抗时，轻轻甩去切片上的PBST，并迅速用足量二抗溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，室温孵育1小时。
    注意：若存在内源性生物素干扰问题，可使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗替代生物素化二抗。若在步骤1.10中使用HRP标记的二抗，则跳至步骤1.14。
11. 用PBST洗涤切片5分钟，重复3次。
12. 通过将0.5 µL SA-HRP（辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素）加入499 µL PBS中，配制SA-HRP溶液（两片切片使用500 µL）。最终浓度为1 µg/mL。
13. 孵育SA-HRP溶液时，轻轻甩去切片上的PBST，并迅速用足量SA-HRP溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，室温孵育0.5小时。
14. 用PBST洗涤切片5分钟，重复3次。
15. 根据制造商说明书，用稀释缓冲液稀释荧光素-酪胺，配制荧光素-酪胺溶液（例如，将5 µL荧光素-酪胺加入496 µL稀释缓冲液中）。
16. 进行荧光信号放大时，轻轻甩去切片上的PBST，并迅速用足量荧光素-酪胺溶液覆盖切片。将切片置于湿盒中，室温孵育1分钟。可根据需要调整孵育时间以获得理想的荧光强度。将切片转移至含PBST的考普林瓶中以终止反应。用PBST洗涤切片3分钟，重复2次。
17. 可在荧光显微镜下快速检查信号以确认结果。若不使用盖玻片，可在每张切片上滴加一滴甘油:PBS（1:1）以保持样本湿润。用PBST洗涤切片3分钟，重复2次。切片可在下一步操作前于4 °C在PBST中保存数天。

2. 去除第一抗体

1. 将切片置于275 mL沸腾的柠檬酸钠溶液（10 mM，pH = 6.0）中，至少8分钟。将切片平放在一个14 × 9.5 × 9 cm³（宽 × 长 × 高）带盖的移液枪头盒底部，并在700 W微波炉中以70%功率微波加热8分钟，以保持溶液持续沸腾。若需延长脱蜡时间，可能需要补充沸腾的柠檬酸钠缓冲液，以确保切片始终浸没在缓冲液中。从微波炉中取出移液枪头盒，打开盖子，让溶液在室温下冷却至少20分钟。
2. 将切片转移至含有PBST的考普林瓶中。用PBST洗涤5分钟，重复3次。若下一步操作不能立即进行，可将切片在室温下保存于含PBST的考普林瓶中数小时，或在4 °C下保存1–2天。

3. 使用第二抗体染色

1. 从封闭步骤开始，按照步骤1.5至步骤1.14的相同流程操作。在信号显色步骤（步骤1.15和步骤1.16）中，使用发射不同荧光光谱的荧光素-酪胺试剂。
   注意：可通过该方法多次剥离切片，以实现多重染色。最后一次抗体染色无需使用荧光素-酪胺作为报告系统，可采用荧光标记的二抗来显示最后一种一抗的信号。
2. 若需进行细胞核复染，将切片在室温下与2 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst溶液孵育1分钟，随后用PBST洗涤2次，每次3分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
生物素标记的驴抗小鼠	JacksonImmuno	715-066-151	1:500 稀释
生物素标记的驴抗兔	JacksonImmuno	711-066-152	1:500 稀释
DAPI	BioLegend	422801	2 μg/mL，溶于蒸馏水
荧光显微镜	ECHO	Revolve 4
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素	JacksonImmuno	016-030-084	1:1000 稀释
微波炉，700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
小鼠抗CYP2F2	Santa Cruz,	SC-374540	1:250 稀释
小鼠抗TH	Santa Cruz,	SC-25269	1:1000 稀释
正常驴血清	JacksonImmuno	017-000-121	2% 血清，溶于PBST
兔抗20αHSD	Kerafast,	EB4002	1:500 稀释
兔抗3βHSD	TransGenic,	KO607	1:250 稀释
兔抗TH	NOVUS,	NB300-109	1:1000 稀释
兔抗β-catenin	Abcam,	ab32572	1:500 稀释
链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）	JacksonImmuno	016-303-084	1:1000 稀释
TSA Cy3 酪胺	PerkinElmer	SAT704B001EA	1:100 稀释
TSA 荧光素酪胺	PerkinElmer	SAT701001EA	1:100 稀释