多重免疫荧光成像分析对免疫治疗耐药的T细胞亚群

摘要

来源：Granier, C., 等 多重免疫荧光分析与肿瘤内PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ T细胞的定量。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种 原位 利用荧光多光谱成像技术分析肿瘤组织中不同亚群的浸润性T细胞。将肾细胞癌组织冷冻切片用抗体处理，标记表达特定抑制性受体并呈现免疫治疗耐受表型的CD8+ T细胞。通过多光谱显微镜观察标记后的切片，以鉴定不同的CD8+ T细胞亚群。 关键词：荧光多光谱成像，肿瘤组织，浸润性T细胞，肾细胞癌，冷冻切片，CD8+ T细胞，抑制性受体，免疫治疗耐受表型，多光谱显微镜

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行

1. 肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的原位免疫荧光染色

1. 操作指南
   1. 所有实验步骤均在室温下进行。
   2. 所有步骤中的稀释均使用Tris缓冲盐水（TBS；参见材料表）。
   3. 除一抗孵育后步骤外，其余所有步骤均使用TBS洗涤。一抗孵育后的洗涤应使用含Tween20的Tris缓冲盐水（TBST，参见材料表）。缓冲液的组成与配制方法见表1。
   4. 抗体孵育使用湿盒，洗涤使用染色缸。
   5. 操作过程中切勿让组织切片干燥。
2. 预处理
   1. 将载有组织样本的玻片解冻，并用纸巾小心擦干样本周围的玻片表面。使用疏水屏障笔标记包含组织的反应区域（参见材料表），干燥2分钟。
   2. 用100%丙酮固定样本5分钟，干燥2分钟，再用TBS洗涤10分钟。
3. 封闭与阻断
   1. 用3滴0.1%的亲和素预处理玻片10分钟，轻敲和/或轻弹玻片以均匀分布亲和素并去除气泡；随后用3滴0.01%的生物素处理10分钟（参见材料表），轻敲和/或轻弹。用TBS洗涤。
   2. 进行Fc受体阻断：加入100 µL用TBS稀释的5%（体积比）正常血清。血清来源应与标记的二抗或三抗的宿主物种相同（参见材料表）；本实验使用驴血清。孵育30分钟。
   3. 在孵育期间，短暂离心抗CD8、程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白-3（Tim-3）抗体（材料表）。按照表2所述，在TBS中配制一抗混合液。
4. CD8、PD-1和Tim-3的免疫染色
   1. 配制一抗混合液。参见材料表和表2获取所用抗体（抗CD8、PD-1、Tim-3及其相应的二抗）及其浓度信息。
   2. 轻敲和/或轻弹去除步骤1.3.2中残留的驴血清。在湿盒中加入100 µL未标记的一抗混合液，孵育1小时。
   3. 在孵育期间，短暂离心Cy5标记的抗兔抗体、Alexa Fluor 488标记的抗山羊抗体以及生物素化的抗小鼠抗体，并按照表2所述配制二抗混合液。
   4. 用TBST洗涤玻片5分钟，然后干燥。
   5. 在湿盒中加入100 µL二抗混合液，孵育30分钟。
   6. 按照表2所述配制含Cy3标记链霉亲和素的三抗混合液。
   7. 用TBS洗涤玻片10分钟，然后干燥。
   8. 加入100 µL三抗混合液，孵育30分钟。
   9. 用TBS洗涤玻片10分钟，然后干燥。
5. 封片
   1. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的封片剂（DAPI浓度为1.5 µg/mL）封片，盖玻片应适用于荧光显微镜观察（参见材料表）。
      注意：每项实验均设阴性对照，使用与实验抗体浓度相同的同型对照抗体。本染色实验中使用小鼠IgG1、兔IgG和山羊IgG阴性对照抗体（参见材料表）。阳性对照使用人增生性扁桃体组织，该组织已知对所检测标志物呈阳性，每项实验均设此对照。典型染色结果见结果部分（图1）。CD8、PD-1和Tim-3的单染应分别单独进行（每张玻片仅染一种抗体），预处理条件相同，但不加DAPI。另需设置一张在相同实验条件下不加任何抗体、仅使用含DAPI封片剂的玻片。还应设置一张在相同实验条件下不加任何抗体且不加DAPI的玻片用于成像。

2. 荧光分析与自动细胞计数

1. 使用自动显微镜进行图像采集
   1. 创建一个实验方案。
      1. 打开自动显微镜软件和荧光光源。
      2. 在菜单栏中，点击“File”（文件），“Create protocol”（创建方案），选择“DAPI”、“FITC”和“TRITC”。
      3. 点击“Next”（下一步），“Tissue section”（组织切片），再点击“Next”（下一步），“Protocol name”（方案名称）。输入一个名称，例如“CD8-PD-1-Tim-3”，点击“Next”（下一步）并点击“Save”（保存）。
      4. 手动将一张载玻片放置在载物台上。
      5. 在菜单栏中，点击“setup”（设置）和“settings”（参数设置）。在弹出的新窗口中点击“Set home Z”（设置Z轴原点）。
      6. 使用阳性对照载玻片调整曝光时间，即使用DAPI染色的CD8、PD-1和Tim-3三重标记样本。
      7. 在控制栏中，点击“set exposure”（设置曝光）。
      8. 为每个滤光片调整曝光时间，直至获得足够但未饱和的信号。
      9. 对于单色成像，请执行以下操作：
      10. 选择“acquisition”（采集），在“autofocus”（自动对焦）下选择DAPI滤光片。
      11. 在“scan area limit”（扫描区域限制）中，将物镜移至载玻片的左上角，点击“Mark”（标记）；同样操作标记右下角。
          注意： 此步骤用于划定在4X下进行低倍成像（LP成像）的区域；请确保标记范围完整覆盖系列样本的所有区域。
      12. 对于高倍成像（HP成像），请执行以下操作：
      13. 在“Autofocus”（自动对焦）下选择“DAPI”。
      14. 在“Acquisition”（采集）栏下选择“DAPI”、“FITC”、“Cy3”和“Cy5”，点击“OK”。在菜单栏中点击“File”（文件）和“Save protocol”（保存方案）。
   2. 扫描载玻片。
      1. 通过点击菜单栏中的“File”（文件）和“Load protocol”（加载方案）来加载已保存的方案。点击“Start”（开始）。
      2. 输入“Lab ID”（实验室ID，用于图像存储的文件夹路径）。输入“Slide ID”（载玻片ID）以标识该载玻片。点击“Next”（下一步）。
      3. 点击“Monochrome Imaging”（单色成像），在明场光下扫描整张载玻片，并使用4倍物镜获取连续图像。
         注意： 此步骤生成载玻片的灰度概览图像。
      4. 点击“Find Specimen”（寻找样本）。选择需在低分辨率（4x）下扫描的组织区域：按住“Ctrl”键，使用光标点击选择或取消选择相应视野（图2A）。
      5. 点击“LP Imaging”（低倍成像，4x成像），以获取每个视野的荧光红、蓝、绿图像。
      6. 对于高倍视野选择，按住“Ctrl”键，使用光标点击选择或取消选择对应于高分辨率（20x）扫描区域的视野。选择5个视野（图2B）。
      7. 点击“HP Imaging”（高倍成像，20x成像），以获取每个视野的多光谱图像（图2C）。
      8. 点击“Data Storage”（数据存储），将图像保存至最初在LabID中选定的文件夹。
         注意： 整个流程在图2中进行了总结和图示。对于每个步骤（组织检测、视野选择），用户可逐步优化并训练算法，以实现全自动扫描流程。

表1：TBS和TBST缓冲液的组成。 TBS用于抗体混合和稀释。洗涤步骤中均使用TBS，但在一抗孵育后的洗涤中建议使用TBST。

	TBS	TBST
Tris-HCl	0.05 M	0.05 M
NaCl	0.15 M	0.15 M
Tween 20	-	0.05%
pH	7.6	7.6
配制方法	1片溶于500 mL H2O

表2：CD8-PD-1-Tim-3免疫荧光染色所用抗体混合液的详细组成。 针对每种一抗、二抗和三抗混合液，均给出了在相应体积TBS中进行稀释的配比，以配制总体积为1 mL的溶液。每张切片的总反应体积为100 µL，适用于2 cm²的组织区域。

一抗体积			终体积 = 1 mL
兔抗 CD8	小鼠抗 PD-1	山羊抗 Tim-3	TBS
1.6 µL	2 µL	30 µL	966.4 µL
二抗体积
Cyan 5 抗兔	生物素标记抗小鼠	Alexa Fluor 488 抗山羊	TBS
3.3 µL	2 µL	2.5 µL	992.2
三抗体积
	Cy3 标记链霉亲和素		TBS
	3.3 µL		996.7

结果

图1：扁桃体石蜡包埋组织中的CD8-PD-1-Tim-3免疫染色。 选择石蜡包埋的组织切片而非冷冻保存的切片进行三重免疫染色。脱蜡和再水化后，采用先前为冷冻保存切片开发的相同染色方案。CD8+ T细胞位于生发中心外，而表达PD-1的非CD8+ T细胞则聚集在生发中心内。显微镜放大倍数为20倍，比例尺代表20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vectra 3 自动化定量病理成像系统	Perkin Elmer	CLS142338
inForm 细胞分析软件 2.1	Perkin Elmer	CLS135781
R 软件	https://www.r-project.org
Dakopen 划界笔	Dako	S2002
Tris 缓冲盐水 TBS 片剂	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH 7.6，100 片
含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7.6，100 片
生物素封闭系统	Dako	X0590	含 0.1% 亲和素和 0.01% 生物素
正常驴血清	Jackson Immunoresearch	017-000-001	体积分数 5% 浓度
含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂	Sigma-aldrich	F6057	浓度 1.5 µg/mL
Knittel 玻璃盖玻片	Knittel Gläser,	100039	24×60 mm，100 片
兔抗 CD8 单克隆抗体，克隆号 P17-V	novus	NBP1-79055	使用浓度 4 µg/mL
小鼠抗 PD-1 单克隆抗体，克隆号 NAT	abcam	ab52587	使用浓度 2 µg/mL
山羊抗 Tim-3 抗体	R&D	AF2365	使用浓度 3 µg/mL
兔抗 PD-L1 单克隆抗体，克隆号 SP142	Roche	7309457001	使用浓度 1 µg/mL
AF647 标记的小鼠抗泛角蛋白单克隆抗体，克隆号 C11	Cell Signalling	4528	使用浓度 0.5 µg/mL
山羊抗人半乳糖凝集素-9（gal9）抗体	R&D	AF2045	使用浓度 0.3 µg/mL
Cyan 5 标记的驴抗兔 IgG 抗体	Jackson Immunoresearch	711-175-152	使用浓度 5 µg/mL
生物素标记的 F(ab'2) 片段驴抗小鼠 IgG 抗体	Jackson Immunoresearch	715-066-150	使用浓度 3 µg/mL
Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊 IgG 抗体	abcam	ab150133	使用浓度 5 µg/mL
Cy3 标记的链霉亲和素	Amersham	PA43001	使用浓度 3 µg/mL
阴性对照小鼠 IgG1 抗体	Dako	X0931	使用浓度 2 µg/mL
山羊血清来源的 IgG	Sigma-aldrich	I5256	使用浓度 3 µg/mL
兔血清来源的 IgG	Sigma-aldrich	I5006	使用浓度 4 µg/mL