一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

摘要

来源：Samrat, S. K. 等，利用免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。

方案

1. 细胞接种与病毒感染

1. 在病毒感染前 20–24 小时，将 5 × 10⁴ 个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞或其他待检测细胞接种于含生长培养基（添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））的 4 孔 11 mm 梯度载玻片中。将细胞置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养。
   注意： 感染时每个孔的细胞融合度应达到 70–80%。
2. 次日，移除生长培养基，并用 Medium-199 培养基以每细胞 4–10 pfu 的感染复数范围对细胞进行病毒感染。将感染病毒的细胞在 37 °C 下孵育 1 小时，孵育期间持续轻轻振荡载玻片。
3. 孵育 1 小时后，移除 Medium-199 培养基，并补充生长培养基。
   注意： 可在此步骤或病毒吸附前加入干扰不同感染阶段的药物。
4. 将病毒感染的细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育不同时间段。

2. 固定与通透处理

1. 在适当的感染时间，用磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤感染的细胞3次，并加入200 μL freshly prepared in PBS的4%多聚甲醛。室温下孵育8–10分钟，以固定每个孔中的细胞。
2. 吸弃多聚甲醛，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。第三次洗涤后彻底吸除 PBS^rd 洗涤。
3. 每孔加入 100 μL 0.2% 非离子型表面活性剂，孵育 5–10 分钟以透化细胞。
4. 吸弃非离子型表面活性剂，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。

3. 免疫荧光染色

1. 彻底吸除 PBS，每孔加入 200 μL 封闭缓冲液（含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 5% 马血清的 PBS），于室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
2. 在封闭缓冲液中加入经实验确定浓度的针对感染细胞蛋白 0 的一抗（兔抗 ICP0 多克隆抗体），于室温孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。
3. 用封闭缓冲液洗涤 3 次，每次孵育 10 分钟。加入 Alexa 594 标记的 goat anti-rabbit 二抗（按 1:400 比例用封闭缓冲液稀释），于室温孵育载片 1 小时，随后用封闭缓冲液洗涤 3 次，每次间隔 10 分钟。
4. 最后用 PBS 洗涤载片一次，以去除残留的 BSA 和马血清。
5. 加入一滴含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，并用透明指甲油封固。

4. 共聚焦成像

1. 使用共聚焦显微镜时，将Alexa 594的波长设置为590–650 nm，DAPI的波长设置为410–520 nm。选择1024 x 1024的图像格式和8次线平均，以获取高分辨率图像。
2. 在共聚焦显微镜下分析4孔载玻片上的每个孔。使用100X物镜获取代表性细胞图像，如图1和图2所示。
3. 对于大量细胞的计数，使用40X物镜连续拍摄多个视野的图像。
   注意：每个感染时间点的每个感染样本需要拍摄5–10张图像，以累计超过200个感染细胞。
4. 在每次实验中，所有需要比较的样本应使用相同的共聚焦参数进行拍照。

5. 细胞核分析 与 细胞质分布

1. 使用共聚焦显微成像软件打开项目。从图像中选择需要进行细胞核计数的细胞区域 与 ICP0的胞质分布
2. 点击顶部菜单中的“数量”选项卡，然后从工具菜单中选择“排序 ROI”。
3. 从顶部菜单中选择“绘制线条”，在待分析的细胞上绘制一条纵向线。
   注意： 直方图将显示沿该线段的ICP0和DAPI荧光强度。在直方图中，蓝色线条代表DAPI像素，标记细胞核的边界，而红色线条代表ICP0像素。
4. 根据背景染色，为每次实验中ICP0强度设定恒定阈值，以分析ICP0的亚细胞分布。
   1. 如示例所示 图2如果红色信号在核区域内的平均值低于阈值，但在蓝色边界之外高于阈值，则将红色信号归类为主要位于细胞质中。
   2. 如果红色信号在整个细胞核内均高于阈值，并延伸至蓝色信号边界之外，则将红色信号归类为细胞核与细胞质共定位。
   3. 如果红色信号在细胞核内的强度高于阈值，但在蓝色信号边界外的平均强度低于阈值，则将红色信号归类为核定位。
5. 对每个样本在不同感染时间点统计超过200个感染细胞，并以柱状图展示ICP0随时间的定位变化图3).

结果

图 1：HSV-1 感染过程中 ICP0 的动态转运。 在 4 孔载玻片上培养的 HEL 细胞以每细胞 10 pfu 的感染复数接种 HSV-1 原型株（F 株）。在感染后 1、5 和 9 小时（hpi），细胞被固定、透化，并依次与兔抗 ICP0 和小鼠抗 PML 一抗孵育，随后与 Alexa 594 标记的抗兔二抗和 Alexa 488 标记的抗小鼠二抗孵育，使用 100X 物镜进行成像。早幼粒细胞白血病（PML）蛋白作为 ND10 核体的标志蛋白，在感染后 5 和 9 小时因 PML 蛋白降解而消失。比例尺 = 10 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞与病毒
人胚胎肺成纤维细胞（HEL 细胞）	Dr. Thomas E. Shenk（普林斯顿大学）		HEL 细胞在添加 10% FBS 的 DMEM 培养基中培养
HSV-1 病毒储备液（F 株）	Dr. Bernard Roizman 实验室
培养基
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Invitrogen	11965-092
胎牛血清（FBS）	Sigma	F0926-500ml
Medium-199（10X）	Gibco	11825-015
试剂
4 孔 11 mm 错列式载玻片	Cel-Line/Thermofisher Scientific	30-149H-BLACK
16% 甲醛溶液（w/v，无甲醇）	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Fisher 试剂	BP151-1C0
牛血清白蛋白（BSA）	Calbiochem	CAS 9048-46-8
马血清	Sigma	H1270
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，pH 7.4）	Dr. Haidong Gu 实验室
NaCl	Fisher Bioreagent	BP358-212
KH2PO4	Fisher Bioreagent	BP362-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
Na2HPO4	Fisher Bioreagent	BP332-500
封闭缓冲液（含 1% BSA 和 5% 马血清的 PBS）	Dr. Haidong Gu 实验室
兔抗 ICP0 抗体	Dr. Haidong Gu 实验室
PML（PG-M3）- 小鼠单克隆 IgG	Santa Cruz Biotechnology	SC-966
Alexa Fluor 594-山羊抗兔 IgG	Invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A11001
含 DAPI 的 Vectashield 封片介质	Vector Laboratories	H-1200
巴斯德吸管	Fisher Brand	13-678-20D
指甲油	Sally Hansen
仪器设备
共聚焦显微镜	Leica SP8
共聚焦软件	Leica LAS X 应用套件
Excel 软件	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 培养箱	Thermo Scientific	订货号 51026282