一种体外鉴定小鼠肺部固有和适应性免疫细胞的方法

摘要

来源：Christofides, A., 等. 小鼠肺部固有免疫与适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析. 可视化学期刊 (2021).

本视频展示了一种用于鉴定小鼠肺组织中定居免疫细胞的体外技术。从小鼠肺组织中分离目标免疫细胞后，使用针对天然免疫和适应性免疫细胞特定标志物的荧光标记抗体混合物对细胞表面进行标记。此外，还利用一种细胞内标志物对单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞进行标记。随后通过流式细胞术鉴定各类免疫细胞类型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术切除与组织制备

1. 通过腹腔注射 1 mL 三溴乙醇（按标准方案配制；材料表）处死小鼠。
   注意：在肺部研究中应避免使用 CO₂ 窒息法，因其可能引起肺损伤，并改变肺免疫细胞的特征和性质。也应避免颈椎脱位法，因其可能导致肺部机械性损伤。
2. 将小鼠转移至洁净且专用的手术区域。
3. 用针头或胶带固定小鼠四肢，使其背部朝下。使用 70% 乙醇对腹部皮肤进行消毒。
4. 从颈部至腹部沿中线切开皮肤，小心剥离胸腔区域的皮肤。
5. 小心移除胸骨和肋骨。
6. 使用 18–21 G 针头向右心室直接注入 10 mL 冷磷酸盐缓冲液（PBS），灌注至肺组织完全变白。
7. 在不接触肺组织的情况下，小心移除胸腺和心脏。
8. 轻柔地将肺组织从周围组织中分离，并转移至含有冷牛血清白蛋白（BSA）缓冲液的离心管中（表 1）。
   注意：在进一步制备单细胞悬液前，应尽量清除肺组织周围的所有脂肪组织，以免影响检测结果。

2. 单细胞悬液的制备

1. 将肺组织转移至一个空的培养皿中，用两把精细的手术刀将其切碎。将所有切碎的肺组织转移至一个新的50 mL锥形管中。用5 mL消化缓冲液冲洗培养皿，并将冲洗液加入含有切碎肺组织的50 mL管中（表1）。
   注意：消化缓冲液应在使用前立即配制。使用5 mg/mL的胶原酶。将1或5 mg胶原酶与BSA缓冲液或无蛋白PBS混合并未能改善结果（图1）。
2. 拧紧管盖，将肺组织在37 °C、150 rpm转速的摇床上消化30分钟。加入10 mL冷的BSA缓冲液以终止反应。
3. 消化完成后，使用18 G针头混合并溶解肺组织碎片。在新的50 mL锥形管顶部放置一个70 µm滤网筛。
   注意：使用孔径更小的滤网可能导致主要髓系细胞群的丢失。
4. 将消化后的肺组织混合物缓慢直接转移至滤网上。使用10 mL注射器活塞的橡胶端在滤网上碾压残留的肺组织碎片。用BSA缓冲液冲洗滤网上的处理物。
5. 将单细胞悬液在4 °C下以350 × g离心8分钟。
6. 小心弃去上清液，并将细胞重悬于1 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中。使用1 mL移液器充分混匀，在室温下孵育90秒。
7. 加入10 mL冷的BSA缓冲液以终止反应，并在4 °C下以350 × g离心7分钟。小心弃去上清液，将沉淀重悬于染色缓冲液中，用血细胞计数板进行细胞计数。
8. 将细胞重悬至浓度为5 × 10⁶ 个细胞/mL，并用于表面染色（见第2节）。
   注意：为此目的，可将细胞接种于96孔圆底板中，随后进行抗体染色和洗涤步骤。若无板式离心机，可使用流式管代替板。采用本方案，可从一只6–10周龄、体型中等的C57BL/6小鼠肺组织中获得约15–20 × 10⁶ 个细胞。

3. 表面抗体染色

1. 将 2 × 10⁶ 个细胞以每孔 200 µL 的体积转移至 96 孔板中。在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心 7 分钟。同时，通过将抗-16/32 抗体按 1:100 比例稀释于染色缓冲液中，制备 Fc 阻断溶液（表 1）。
2. 将细胞重悬于 50 µL 预先配制的 Fc 阻断溶液中（材料表），并在 4 °C 或冰上孵育 15–20 分钟。
3. 加入 150 µL 染色缓冲液，并在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。同时，将表面抗体按 1:100 比例稀释于染色缓冲液中，制备表面抗体混合液（表 2）。
   注意： (i) 用于 Fc 阻断的抗-16/32 抗体可与表面抗体一同加入同一混合液中。(ii) 若使用可固定活力染料，需将其以 1:1,000 比例加入表面抗体混合液中。
4. 将细胞重悬于 50 µL 预先配制的表面抗体混合液中，在 4 °C 避光孵育 30–40 分钟。用染色缓冲液洗涤细胞两次。
   ​注意： 若无需进行胞内染色，可将细胞重悬于 200 µL 染色缓冲液中，直接进行流式细胞仪数据采集。或者，可将细胞固定后于 4 °C 保存，以备后续检测。建议在 24 小时内完成流式细胞术检测。

4. 细胞固定和细胞内染色

1. 通过将 FoxP3/转录因子染色缓冲液套装（表1）中的固定/透化浓缩液与固定/透化稀释液按3:1的比例混合，制备固定/透化缓冲液（Fix/Perm Buffer）。
2. 按照第3节所述，在96孔板的每个孔中加入50 µL预配制的Fix/Perm Buffer重悬细胞，并在4 °C避光孵育20–25分钟。
3. 将10x透化缓冲液用纯化去离子水按1:10比例稀释，以制备1x透化缓冲液。
4. 用1x透化缓冲液洗涤细胞一次。同时，在1 mL透化缓冲液中按1:100比例稀释细胞内抗体，配制细胞内抗体混合液。
5. 在96孔板的每孔细胞中加入50 µL预配制的表面抗体混合液重悬细胞，并在4 °C避光孵育40分钟。
6. 用透化缓冲液洗涤细胞一次，再用染色缓冲液洗涤一次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中。
   注意：若无配备板式读板器的流式细胞仪，需将细胞转移至流式细胞管中。
7. 在流式细胞仪上每样本至少采集1.5 × 10⁶个细胞。
   注意：对于单色及未染色对照样本，每样本采集0.5–1 × 10⁶个细胞即可。建议对所用各抗体进行滴定，以获得最佳染色效果并降低成本。本实验方案使用FoxP3染色缓冲液套装配制的Fix/Perm Buffer进行了优化。由于CD68为胞浆标记而非核标记，其他透化溶液（如低浓度多聚甲醛或不同厂商的Cytofix/Cytoperm试剂盒）可能也足够适用。

表1：缓冲液。

BSA 缓冲液	PBS + 0.5% 牛血清白蛋白
消化缓冲液	预热（37 °C）的 BSA 缓冲液 + 5 mg/mL I 型胶原酶 + 0.2 mg/mL DNase I
染色缓冲液	PBS + 2.5% 胎牛血清
固定/破膜缓冲液	Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒中的固定/破膜稀释液与固定/破膜浓缩液按 3:1 体积比混合
破膜缓冲液	Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒中的 10x 破膜缓冲液用去离子纯水稀释 10 倍

表2：单克隆抗体的使用。

抗原	克隆	荧光素	稀释比例	表面/胞内
CD45	30-F11	APC/CY7	1:100	表面
Gr-1	RB6-8C5	BV421	1:100	表面
CD68	FA-11	PerCPCy5.5	1:100	胞内
CD11b	M1/70	PECy7	1:100	表面
Siglec F	S17007L	FITC	1:100	表面
CD11c	N418	BV650 或 BV510	1:100	表面
CD64	X54-5/7.1	PE/Dazzle 594	1:100	表面
MHC-II	M5/114.15.2	AF700	1:100	表面
CD103	2.00E+07	PE / FITC	1:100	表面
活/死可固定远红死细胞染色试剂盒		远红（APC）或蓝色（BV510）	1:1000	表面
CD3	17A2	PE	1:100	表面
B220	RA3-6B2	AF488	1:100	表面
NK1.1	PK136	FITC	1:100	表面
CD24	30-F1	PE	1:100	表面
MERTK	2B10C42	PE	1:100	表面
F4/80	BM8	BV605	1:100	表面
CX3CR1	SA011F11	PE	1:100	表面
FcBlock (CD16/32)	93		1:100	表面

结果

图1：使用含0.5% BSA的预热PBS中5 mg/mL胶原酶1可获得最佳的细胞解离效果。 在所有不同条件下，均额外加入0.2 mg DNA酶I。缩写：BSA = 牛血清白蛋白；FSC-A = 前向散射光峰面积；L/D = 活/死染色；SF = Siglec F。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器推杆	EXELINT	26265
18 G 针头	BD Precision Glide Needle	305165
21 G 针头	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL 圆底离心管	Falcon	3520
70 μm 细胞筛	ThermoFisher	22363548
96 孔板	Falcon/corning	3799
ACK 裂解缓冲液	ThermoFisher	A10492-01
抗小鼠 CD11b 抗体	Biolegend	101215	详情见表 2
抗小鼠 CD11c 抗体	Biolegend	117339 / 117337	详情见表 2
抗小鼠 CD45 抗体	Biolegend	103115	详情见表 2
抗小鼠 CD64 抗体	Biolegend	139319	详情见表 2
抗小鼠 CD68 抗体	Biolegend	137009	详情见表 2
抗小鼠 GR-1 抗体	Biolegend	108433	详情见表 2
抗小鼠 Siglec F 抗体	Biolegend	155503	详情见表 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	详情见表 2
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	详情见表 2
CD24	Biolegend	138503	详情见表 2
CD3	Biolegend	100205	详情见表 2
离心机
I 型胶原酶	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	详情见表 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
乙醇
F4/80	Biolegend	123133	详情见表 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	详情见表 2
胎牛血清	R&D Systems
精细锯齿镊	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	ThermoFisher	00-5523-00
安全手术刀 Futura	Merit Medical Systems	SMS210
活/死细胞可固定远红死细胞染色试剂盒	ThermoFisher	L34973	详情见表 2
MERTK	Biolegend	151505	详情见表 2
MHC-II	Biolegend	107621	详情见表 2
NK1.1	Biolegend	108705	详情见表 2
轨道摇床	VWR	Model 200
培养皿	Falcon	351029
台式冷藏离心机	SORVAL ST 16R
小型弯剪	Roboz Surgical Instrument Co