测量小鼠血清中针对试验性疫苗的免疫球蛋白G水平

摘要

来源：Zeng, X. 等，评估纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫反应。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了一种用于评估预先免疫小鼠对新型纳米乳剂佐剂疫苗抗体免疫应答的方法。通过测定IgG抗体滴度，证实免疫接种可增强抗体应答。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）HI抗原蛋白的制备

1. 获取铁离子表面决定因子B（Fe ion surface determining factor B）IsdB）和α-溶血素突变体（Hla）来自商业来源的克隆（参见 材料表），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增以扩增 IsdB 和 Hla 基因，并将其产物连接至PGEX-6P-2质粒（商业获取；参见 材料表）。使用Xl/blue菌株的载体进行筛选 大肠杆菌.
2. 将阳性克隆转化进入 E. coli BL21 感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物进行扩增。
3. 使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside）诱导表达抗原，并采用多模式层析（MMC）纯化试剂盒进行分离（参见 材料表).
4. 表征抗原蛋白并使用全自动纯化仪进行纯化。
   1. 使用市售的亲和层析树脂从澄清裂解液中亲和纯化谷胱甘肽S-....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5424-小型高速离心机FA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96孔板	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
Balb/c小鼠	北京华阜生物技术有限公司
BCIP/NBT	福州迈新生物技术开发有限公司，中国	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 微孔板读板仪	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21 感受态细胞	Merck millipore, Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
考马斯亮蓝G-250染色液	MIKX，中国	DB236
脱色液	BOSTER，中国	AR0163-2
电热恒温培养箱 HH-B11-420	上海跃进医疗器械厂，中国	null
电泳仪	北京六一仪器厂，中国	DYCZ-25D
凝胶成像系统	Tanon, USA	null
谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST	美5生物，中国	affinity chromatography resin
H2SO4	成都科试化工有限公司，中国	7664-93-9
HI重组蛋白	第三军医大学，中国	110-27-0
HRP-山羊抗小鼠IgG	百奥龙，中国	BF03001
HRP-山羊抗小鼠IgG1	百奥龙，中国	BF03002R
HRP-山羊抗小鼠IgG2a	百奥龙，中国	BF03003R
HRP-山羊抗小鼠IgG2b	百奥龙，中国	BF03004R
接种环	海门飞云有限公司，中国	YR-JZH-1UL
IsdB 和 Hla 克隆	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	null
异丙基肉豆蔻酸（药用辅料）	SEPPIC, 法国	null
异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷	fdbio，中国	FD3278-1
LB肉汤培养基	北京奥博生物技术有限公司，中国	02-136
低温冷冻离心机	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	null
微孔板洗板机 405 LSRS	Bio Tek Instruments, Inc Highland Park, USA	null
Mini-TBC紧凑型薄膜转移仪	北京东方瑞利有限公司，中国	1658030
MMC填料	东曹（上海）有限公司	22818
MRSA252	美国，ATCC	null
Nanodrop紫外分光光度计	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒	达科威，中国	8012011
PBS	百奥锐，中国	null
PCR扩增仪	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-目的基因重组质粒	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	B3528G
磷钨酸	G-CLONE，中国	CS1231-25g
移液器	Eppendorf, Germany	3120000844
聚氧乙烯蓖麻油（药用辅料）	阿拉丁，中国	K400327-1kg
一抗	实验室自制：来自免疫小鼠的阳性血清	null	详见参考文献11
丙二醇（药用辅料）	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
蛋白Marker	Thermo Scientific, USA	26616
PVDF转印膜	Invitrogen, USA	88518
扫描电子显微镜	JEOL, 日本	JSM-IT800
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, USA	null
TMB显色液	天根，中国	PA107-01
龟试剂盒	厦门博恩科生物技术有限公司	ES80545
Tween-20	Macklin, 中国	9005-64-5