测量小鼠血清中针对试验性疫苗的免疫球蛋白G水平

摘要

来源：Zeng, X. 等，评估纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫反应。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了一种用于评估预先免疫小鼠对新型纳米乳剂佐剂疫苗抗体免疫应答的方法。通过测定IgG抗体滴度，证实免疫接种可增强抗体应答。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）HI抗原蛋白的制备

1. 获取铁离子表面决定因子B（Fe ion surface determining factor B）IsdB）和α-溶血素突变体（Hla）来自商业来源的克隆（参见 材料表），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增以扩增 IsdB 和 Hla 基因，并将其产物连接至PGEX-6P-2质粒（商业获取；参见 材料表）。使用Xl/blue菌株的载体进行筛选 大肠杆菌.
2. 将阳性克隆转化进入 E. coli BL21 感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物进行扩增。
3. 使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside）诱导表达抗原，并采用多模式层析（MMC）纯化试剂盒进行分离（参见 材料表).
4. 表征抗原蛋白并使用全自动纯化仪进行纯化。
   1. 使用市售的亲和层析树脂从澄清裂解液中亲和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白（参见 材料表).
   2. 使用异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷和多模式色谱法（MMC）纯化重组蛋白。
   3. 使用Triton X-114相分离法去除内毒素。简言之，将1% Triton X-114与重组蛋白洗脱液在0 °C下混合5分钟，确保形成均一溶液，然后在37 °C孵育5分钟，使两相形成。
5. 使用Turtle试剂盒的细菌内毒素检测方法（参见 材料表）检测内毒素浓度。该蛋白抗原的内毒素含量为0.06 EU/µg，低于国际标准（1.5 EU/µg）。
   1. 进行干扰试验，以消除测试产品对内毒素检测可能产生的影响。
      注意： 根据《中华人民共和国药典》2020年版附录规定，内毒素含量应低于5 EU/剂量。基于最大有效稀释倍数（MVD = cL/λ）计算，鲎试剂的灵敏度（λ 0.25 EU/mL）和最大有效稀释倍数为33.3，其中L为供试品的细菌内毒素限值，c为供试品溶液的浓度，当L以EU/m表示时，c等于1.0 mg/mL；λ为凝胶法中鲎试剂标注的灵敏度（EU/mL）。
6. 将抗原（通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[SDS-PAGE]测定为48 kDa）以1.5 mg/mL浓度在无内毒素的无菌水或磷酸盐缓冲液（PBS）中重悬（采用二氯化钠法）。
   ​注意： 蛋白峰时间为13.843 min，纯度为99.4%（高效液相色谱法），蛋白保存于-70 °C。从基因组DNA中提取 S. aureus 菌株 MRSA252（参见 材料表) 用作PCR模板。该 IsdB 使用上游引物 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG 扩增基因
   C-39 和反向引物 59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39
   的 Hla 使用上游引物PHLAF（GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC）和下游引物PHLAR（TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC）对基因进行扩增。

2. 纳米乳液疫苗的制备

1. 按照1:6:3（w/w）的质量比，依次将三种辅料（肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇；见材料表）加入HI抗原蛋白溶液（10 mg/mL）中，并充分搅拌。然后，逐渐加入灭菌纯水至终体积为10 mL，在500 rpm、25 °C条件下搅拌约20分钟。
   注意：本方案制备的纳米乳剂体积为10 mL，三种辅料的质量分别为0.34 g、2 g和1 g。此处的蛋白溶液为工作液，其浓度为最终溶液浓度的10倍。
2. 采用低能乳化法配制纳米乳剂佐剂疫苗（蛋白浓度为1 mg/mL），得到澄清透明的液体溶液。
   注意：空白纳米乳剂（BNE）的制备方法类似，仅以HI代替水。常规乳化法通常需将内相和外相加热至约80 °C进行乳化，随后逐步搅拌冷却。该过程消耗大量能量，最终获得乳剂。

3. 纳米乳佐剂疫苗的物理表征与稳定性

1. 粒径、Zeta 电位及聚合物分散指数（PDI）表征
   1. 取 100 µL 纳米乳佐剂疫苗，用注射用水稀释 50 倍，加入 2 mL 样品用于检测。
   2. 使用 Nano Zetasizer（ZS；参见材料表）在 25 °C 下测定粒径、Zeta 电位和 PDI。
2. 透射电子显微镜（TEM）
   1. 取 10 µL 纳米乳疫苗，用纯水稀释 50 倍，滴加至碳支持膜覆盖的 100 目铜网上，室温下用 1% 磷钨酸（参见材料表）染色 5 分钟。
   2. 用滤纸吸除多余的磷钨酸溶液。
   3. 在透射电子显微镜下观察形态（参见材料表），检查终产品在电镜视野中是否接近稳定且呈圆形，以及是否具有良好的分散性。
3. 扫描电子显微镜（SEM）
   1. 取 10 µL 纳米乳佐剂疫苗，用纯水稀释 50 倍，取 10 µL 预稀释样品滴于硅片上，置于 37 °C 恒温培养箱中孵育 24 小时。
   2. 对制备好的硅片进行铂喷镀 40 秒，冷却至室温。
   3. 在高分辨率扫描电子显微镜下观察所制备样品的形貌特征（参见材料表），判断样品在电镜视野中是否接近稳定、呈球形且分散良好。
4. 形态稳定性
   1. 将 1 mL 纳米乳疫苗样品置于微量离心管中，在室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟，评估新鲜样品的稳定性。
   2. 观察这些新鲜样品的外观，随后进行六次温度循环的热力学稳定性测试（一个循环：4 °C 保存 48 小时，25 °C 保存 48 小时，37 °C 保存 48 小时）。
   3. 离心后静置 15 分钟，观察是否出现丁达尔效应（样品在光照下是否清澈透明）以及是否发生破乳（破乳后表现为明显分层）。
5. SDS-PAGE 和 Western blot
   1. 振荡混匀样品，将 0.6 mL 无水乙醇与 0.3 mL 疫苗混合，室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟。
   2. 将上清液转移至洁净离心管中，用 0.3 mL 水溶解沉淀。经无水乙醇和蒸馏水处理后，分别获得上清液和沉淀溶液（包括空白纳米乳和疫苗），均进行 50 倍稀释。
   3. 混合 2.5 mL 分离胶 A 和 2.5 mL 分离胶 B（参见材料表），加入 50 µL 10% 过硫酸铵，迅速用移液器将溶液注入玻璃板中；混合 1 mL 浓缩胶 A 和 1 mL 浓缩胶 B，加入 20 µL 10% 过硫酸铵至玻璃板中，插入合适大小的梳子，静置至凝固。
   4. 向步骤 3.5.2 获得的稀释样品中加入共 5 µL 的 5× 蛋白上样缓冲液，沸水浴加热 5 分钟。
   5. 将 10 µL 加热后的蛋白样品加入对应加样孔，5 µL 蛋白 Marker 加入 Marker 孔。
   6. 连接电极，开启电泳仪（参见材料表），调节电压至 300 V，当电泳条带距聚丙烯酰胺凝胶底部约 1 cm 时关闭电源。
   7. 取出凝胶，用双蒸水（ddH₂O）冲洗。加入考马斯亮蓝 G-250 染色液（参见材料表）染色 10 分钟。倒出染色液，用染色液和商品化脱色液各冲洗两次，将凝胶微波加热 1 分钟，振荡 10 分钟，并反复更换脱色液直至背景清晰。然后进行凝胶成像（参见材料表）。
      注意：Western blot 的前期处理步骤如 3.5.1–3.5.6 所述。
   8. 用转膜电泳缓冲液浸湿三块滤纸。将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在甲醇中浸泡 30 秒，使用半干式转膜仪进行转膜（两层滤纸、PVDF 膜、电泳凝胶、一层滤纸），电压 23 V，转膜 23 分钟。
   9. 转膜后取出 PVDF 膜，用含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（TBST）洗涤一次。
   10. 将 PVDF 膜置于封闭液（5% 脱脂奶粉溶液）中，4 °C 过夜封闭。
   11. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。
   12. 与一抗（来自免疫小鼠的阳性血清）孵育。将待测一抗（参见材料表）用 TBST 稀释 500 倍（或 100 倍），将封闭后的 PVDF 膜放入一抗溶液中，37 °C 孵育 1 小时。
   13. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。
   14. 与二抗孵育（参见材料表）。将碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠二抗用 TBST 稀释 5,000 倍，将 PVDF 膜放入二抗溶液中，37 °C 孵育 40 分钟。
   15. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤四次，每次 10 分钟。
   16. 将 PVDF 膜浸入碱性磷酸酶底物氮蓝四唑（NBT）和 BCIP（5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）的混合液中（用量以刚好浸没膜为宜）进行显色（参见材料表），阳性结果呈紫色。
       ​注意：结果应为清晰的紫色条带，样品条带与抗原的分子量应在标记位置一致。

4. 肌肉注射后对该疫苗抗体免疫反应的评估

注意： 小鼠通过肌肉注射纳米乳剂疫苗进行免疫，方法参照已发表的文献。以 PBS 处理的小鼠作为阴性对照。在完成三次免疫后 1 周，采集小鼠血清。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测血清中 IgG 及其亚类 IgG1、IgG2a 和 IgG2b 的水平。

1. 抗原包被：用包被液将HI蛋白抗原稀释至10 µg/mL，每孔加入100 µL至ELISA板中，4 °C过夜孵育。
   注意： 将1.6 g无水碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠溶解于1 L去离子水中，制备包被溶液。
2. 封闭：洗涤平板（三个循环，每个循环300 µL）。每孔加入300 µL封闭液，在37 °C下封闭2小时。
   注意： 封闭液的配制方法是将Tween-20和牛血清白蛋白（BSA）加入PBS中。PBST溶液中BSA的含量为1%。
3. 血清稀释：用PBST将小鼠血清样本稀释100倍（取3 µL血清加入297 µL PBST中，涡旋混匀），每份血清样本使用100 µL。将阳性血清和阴性对照血清用PBST稀释100倍（每4 µL血清加入396 µL PBST中），涡旋混匀。
4. 双倍比稀释：将上述稀释后的实验血清各200 µL加入包被ELISA板的第一排孔中，除第一排和第12排外，其余各孔均加入100 µL PBST^th 逐行进行。从第一行开始进行1:2的连续稀释：将移液器调整至100 µL，从第一行吸取100 µL转移至第二行，用移液器吹打混匀10次。
5. 将血清以多个比例稀释至第11行，并弃去100 µL液体。
6. 根据样本模板，将稀释后的阴性血清和阳性血清分别加入第12行对应的孔中（参见 表1)-100 µL/孔。
7. 用塑料膜密封ELISA板，在37 °C下孵育1小时。
8. 稀释二抗 anti-mouse IgG-HRP（参见 材料表) 用 PBST 以 1:10,000 稀释。
9. 洗涤平板（3个循环，每个循环300 µL）。然后，向每孔加入100 µL稀释的二抗，37 °C孵育40分钟。
10. 染色与终止：洗涤反应板（5个循环，每个循环300 µL）。加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色液（100 µL；参见 材料表) 加入每个孔中。将培养板置于37 °C避光环境中10分钟，随后立即加入50 µL的2 M HCl终止反应₂SO₄.
11. 检测光密度（OD₄₅₀）值，通过酶标仪检测（读取OD₄₅₀ 终止后15分钟内的数值。

表1：ELISA 加标序列和稀释模板。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5424-小型高速离心机FA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96孔板	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
Balb/c小鼠	北京华阜生物技术有限公司
BCIP/NBT	福州迈新生物技术开发有限公司，中国	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 微孔板读板仪	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21 感受态细胞	Merck millipore, Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
考马斯亮蓝G-250染色液	MIKX，中国	DB236
脱色液	BOSTER，中国	AR0163-2
电热恒温培养箱 HH-B11-420	上海跃进医疗器械厂，中国	null
电泳仪	北京六一仪器厂，中国	DYCZ-25D
凝胶成像系统	Tanon, USA	null
谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST	美5生物，中国	affinity chromatography resin
H2SO4	成都科试化工有限公司，中国	7664-93-9
HI重组蛋白	第三军医大学，中国	110-27-0
HRP-山羊抗小鼠IgG	百奥龙，中国	BF03001
HRP-山羊抗小鼠IgG1	百奥龙，中国	BF03002R
HRP-山羊抗小鼠IgG2a	百奥龙，中国	BF03003R
HRP-山羊抗小鼠IgG2b	百奥龙，中国	BF03004R
接种环	海门飞云有限公司，中国	YR-JZH-1UL
IsdB 和 Hla 克隆	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	null
异丙基肉豆蔻酸（药用辅料）	SEPPIC, 法国	null
异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷	fdbio，中国	FD3278-1
LB肉汤培养基	北京奥博生物技术有限公司，中国	02-136
低温冷冻离心机	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	null
微孔板洗板机 405 LSRS	Bio Tek Instruments, Inc Highland Park, USA	null
Mini-TBC紧凑型薄膜转移仪	北京东方瑞利有限公司，中国	1658030
MMC填料	东曹（上海）有限公司	22818
MRSA252	美国，ATCC	null
Nanodrop紫外分光光度计	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒	达科威，中国	8012011
PBS	百奥锐，中国	null
PCR扩增仪	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-目的基因重组质粒	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	B3528G
磷钨酸	G-CLONE，中国	CS1231-25g
移液器	Eppendorf, Germany	3120000844
聚氧乙烯蓖麻油（药用辅料）	阿拉丁，中国	K400327-1kg
一抗	实验室自制：来自免疫小鼠的阳性血清	null	详见参考文献11
丙二醇（药用辅料）	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
蛋白Marker	Thermo Scientific, USA	26616
PVDF转印膜	Invitrogen, USA	88518
扫描电子显微镜	JEOL, 日本	JSM-IT800
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, USA	null
TMB显色液	天根，中国	PA107-01
龟试剂盒	厦门博恩科生物技术有限公司	ES80545
Tween-20	Macklin, 中国	9005-64-5