评估病毒感染细胞中半胱天冬酶介导的病毒与宿主蛋白切割

摘要

来源：Husain, M. 鉴定在甲型流感病毒感染过程中切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序。 J. Vis. Exp. (2022)

该视频展示了一种评估病毒感染细胞中半胱天冬酶（caspase）介导的蛋白质切割的方法。病毒感染后，caspase 被激活，进而降解多种宿主细胞蛋白和病毒核蛋白，而特异性 caspase 抑制剂可阻止这种降解，这一点已通过蛋白质印迹（western blotting）得到证实。

方案

1. 评估流感病毒A（IAV）感染细胞中半胱天冬酶对蛋白质的切割或降解作用

1. 在12孔细胞培养板中每孔接种 3 × 10⁵ 个 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞或 A549 细胞。
   注意：若使用 MDCK 细胞，需确保针对目标蛋白的抗体可识别犬源蛋白。
2. 成对接种各孔，即设置对照组：一孔为未感染-模拟处理样本，另一孔为感染-模拟处理样本；设置实验组：一孔为未感染-抑制剂 A 处理样本，另一孔为感染-抑制剂 A 处理样本。每增加一种抑制剂，相应增加成对的孔数。
3. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 的条件下孵育过夜。
4. 次日，用甲型流感病毒（IAV）（H1N1 亚型或其他亚型）感染细胞。
   1. 为此，将病毒储备液用 400 µL 无血清最低必需培养基（MEM）（见 材料表）稀释，制备病毒接种物，感染复数（MOI）为 0.5–3.0 斑块形成单位（pfu）/细胞 （计算 MOI 时需考虑细胞数量的倍增因素）。
      注意：感染 MDCK 细胞时，需在病毒接种物中加入甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶，终浓度为 1 µg/mL。
5. 移除细胞中的旧培养基（步骤 1.3），用 1 mL/孔无血清 MEM 洗涤细胞 2 次。
6. 向细胞中加入 400 µL 病毒接种物（步骤 1.4.1），在 35 °C、5% 二氧化碳（CO₂） 的条件下孵育 1 小时。
7. 同时，在无血清 MEM 中分别将半胱天冬酶抑制剂（如 Z-DEVD-FMK）、溶酶体抑制剂（如氯化铵，NH₄Cl）或蛋白酶体抑制剂（如 MG132）（见 材料表）稀释至终浓度 40 µM、20 mM 或 10 µM （见 材料表）。后两种抑制剂作为对照。若其中一种抑制剂使用非水溶剂重悬，则用相同体积的该溶剂稀释无血清培养基，作为模拟处理对照。
8. 移除病毒接种物，并按步骤 1.5 的方法洗涤细胞（1 次）。
9. 向细胞中加入 1 mL/孔无血清 MEM，模拟处理或添加抑制剂，然后按步骤 1.6 的条件进行孵育。此时间点记为感染 0 小时。
10. 24 小时后，用 1 mL 注射器活塞（橡胶端）刮取细胞，并转移至 1.5 mL 聚丙烯管中。
11. 在室温下以 12,000 × g 离心 1–2 分钟。用移液器收集上清液。
    注意：此上清液可弃去，或用于空斑实验 以测定释放病毒子代的滴度。
12. 用 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，并按步骤 1.11 的方法再次离心洗涤。
13. 移除上清液，加入 80–100 µL 细胞裂解缓冲液（50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 7.4，150 mM 氯化钠（NaCl），0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.5% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100，以及 1× 蛋白酶抑制剂混合物，见 材料表）裂解细胞，并涡旋混匀。
14. 将样品管在 98 °C 加热 10 分钟，以彻底裂解细胞并制备全细胞裂解液。可将裂解液于 4 °C 保存，次日进行步骤 1.15–1.17 的操作，但为获得最佳结果，建议在同一天内完成后续步骤。
15. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒（见 材料表）测定各样品中的蛋白含量。
16. 将未感染和感染样本中等量蛋白与分子量标记物一起，通过标准 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 进行分离。
17. 将蛋白转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（见 材料表）。
    注意：PVDF 膜在某些 Western 印迹成像系统中可能产生较高背景，需检查其兼容性。
18. 采用其他文献所述方法进行 Western 印迹，以检测目标蛋白。
19. 比较模拟处理组与抑制剂处理组中感染样本条带的蛋白水平。
    注意：若在半胱天冬酶抑制剂处理的感染样本条带中蛋白水平恢复，则表明该蛋白被半胱天冬酶切割或降解；否则，其降解途径为溶酶体或蛋白酶体。
20. 通过测量同一次实验至少三个重复样本中各条带的强度，并以相应的上样对照条带进行归一化，定量分析蛋白恢复水平。
21. 使用任何现代成像仪及配套软件（见 材料表）对 Western 印迹图像进行成像并量化蛋白恢复情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 细胞	ATCC	CRM-CCL-185	人源，上皮细胞，肺组织
氯化铵	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 抑制剂	Sigma-Aldrich	264156-M	又称“InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem”
Complete, Mini 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
山羊抗 NP 抗体			由 Richard Webby（美国田纳西州孟菲斯市圣犹大儿童研究医院）赠予 MH
MDCK 细胞	ATCC	CCL-34	犬源，上皮细胞，肾组织
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
最低必需培养基（MEM）	ThermoFisher Scientific	11095080	根据需要添加 L-谷氨酰胺、抗生素或其他补充物
Odyssey Fc 成像仪，配备 Image Studio Lite 软件 5.2	LI-COR		Odyssey Fc 已被 Odyssey XF 取代，Image Studio Lite 软件已被 Empiria Studio 软件取代。
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23225
Protran Premium 硝酸纤维素膜	Cytiva（原 GE Healthcare）	10600003
兔抗肌动蛋白抗体	Abcam	ab8227
兔抗 cortactin 抗体	Cell Signaling	3502
SeeBlue 预染蛋白质标准品	ThermoFisher Scientific	LC5625
Tris-HCl、NaCl、SDS、脱氧胆酸钠、Triton X-100	Merck
胰蛋白酶（TPCK 处理）	Sigma-Aldrich	4370285