一种用于检测荧光抗生素探针在细菌细胞中积累的测定方法

摘要

来源：Stone, M. R. L.，等。利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种用于测量荧光抗生素探针在细菌细胞内蓄积的实验方法。首先使细菌细胞暴露于外排泵抑制剂，以破坏其跨膜质子梯度，随后加入荧光团标记的抗生素。由于质子梯度被破坏导致外排泵功能受抑，抗生素在细菌内部蓄积。之后裂解细菌细胞，通过测定荧光强度来确认抗生素的蓄积情况。

方案

1. 抗菌活性的评估

注意：所有涉及细菌的操作均应在无菌条件下进行，以避免实验或实验室受到污染。所有培养基在使用前应进行高压灭菌，塑料器皿和移液器等设备必须保持无菌状态。建议在生物安全柜（2级）中进行操作。

1. 将适用于抗生素骨架的细菌菌株的甘油菌种划线接种于溶菌肉汤琼脂培养基（LB，按制造商说明配制）上，于37 °C过夜培养。
   注意： 测试抗菌活性时，所选细菌应根据所使用的抗生素骨架来确定。应从已知对该抗生素敏感的菌种中选择5–10种具有代表性的细菌，并结合实验室的实际操作能力进行考量。如果条件允许，也应测试耐药菌株。以下提供的方案适用于大多数细菌，但需确认是否需要特殊培养条件（例如CO₂培养）。₂，特殊培养基），并根据需要进行调整。在这些条件下成功检测的细菌包括 金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌 和 粪肠球菌
2. 从平板上挑取单个菌落，置于5 mL阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤（CAMHB，按制造商说明配制）中，37 °C过夜培养。
3. 将过夜培养物在CAMHB中约稀释40倍，并培养至对数中期，于600 nm处测定光密度（OD₆₀₀）= 0.4–0.8，体积 5 mL。
4. 将每....

结果

表1. 基于环丙沙星、甲氧苄啶和利奈唑胺的荧光抗生素探针对相应临床相关细菌菌株的抗生素活性，通过肉汤微量稀释法 MIC 测定进行评估。在大多数情况下，这些探针相较于母体药物失去了一部分活性，但仍保留了可测量的抗生素效力（足以用于后续研究）。

		最低抑菌浓度（MIC，µg/mL）
物种	菌株	环丙沙星（Cipro）	Cipro-NBD	Cipro-DMACA

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元，Ultracel-10 膜	Merck	UFC501096
Bruker Avance 600 MHz 核磁共振波谱仪	Bruker
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Celite 545	Sigma-Aldrich	22140-5KG-F
Cygel	ABCAM	Ab109204
FM4-64FX，FM™ 4-64 膜染料的可固定类似物	Life Technologies Australia Pt	F34653
Gamma 2-16 LSCplus 冷冻干燥机	CHRIST
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 离心机	Hettich
LB 培养基	AMRESCO	J106
溶菌酶（来自鸡蛋清） 冻干粉末	Sigma-Aldrich	L6876
Mueller Hinton II 肉汤（阳离子调节）	Becton Dickinson	212322
Sigma 1-15 微型离心机	Sigma-Aldrich
TECAN Infinite M1000 PRO 多功能酶标仪	TECAN