一种用于检测荧光抗生素探针在细菌细胞中积累的测定方法

摘要

来源：Stone, M. R. L.，等。利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种用于测量荧光抗生素探针在细菌细胞内蓄积的实验方法。首先使细菌细胞暴露于外排泵抑制剂，以破坏其跨膜质子梯度，随后加入荧光团标记的抗生素。由于质子梯度被破坏导致外排泵功能受抑，抗生素在细菌内部蓄积。之后裂解细菌细胞，通过测定荧光强度来确认抗生素的蓄积情况。

方案

1. 抗菌活性的评估

注意：所有涉及细菌的操作均应在无菌条件下进行，以避免实验或实验室受到污染。所有培养基在使用前应进行高压灭菌，塑料器皿和移液器等设备必须保持无菌状态。建议在生物安全柜（2级）中进行操作。

1. 将适用于抗生素骨架的细菌菌株的甘油菌种划线接种于溶菌肉汤琼脂培养基（LB，按制造商说明配制）上，于37 °C过夜培养。
   注意： 测试抗菌活性时，所选细菌应根据所使用的抗生素骨架来确定。应从已知对该抗生素敏感的菌种中选择5–10种具有代表性的细菌，并结合实验室的实际操作能力进行考量。如果条件允许，也应测试耐药菌株。以下提供的方案适用于大多数细菌，但需确认是否需要特殊培养条件（例如CO₂培养）。₂，特殊培养基），并根据需要进行调整。在这些条件下成功检测的细菌包括 金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌 和 粪肠球菌
2. 从平板上挑取单个菌落，置于5 mL阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤（CAMHB，按制造商说明配制）中，37 °C过夜培养。
3. 将过夜培养物在CAMHB中约稀释40倍，并培养至对数中期，于600 nm处测定光密度（OD₆₀₀）= 0.4–0.8，体积 5 mL。
4. 将每种荧光抗生素的储备液用无菌水配制成 1.28 mg/mL 的浓度，并用移液器吸取 10 μL 抗生素加入 96 孔板的第一列中。
5. 向第一列加入 90 μL CAMHB，其余各孔加入 50 μL。随后在整块板上进行2倍系列稀释。
6. 充分混匀，然后将对数中期培养物稀释至约 10⁶ 菌落形成单位（CFU）/mL，并向所有孔中加入 50 μL，使终浓度约为 ~5 × 10⁵ CFU/mL
   培养物体积 （mL）＝（培养基体积，单位为 mL）/（OD）₆₀₀ ×1,000
   例如，对于一个OD₆₀₀ 在12 mL所需培养基中接种OD600 = 0.5的菌液时，需将(12/(0.5 × 1,000) = 0.024 mL的菌液加入12 mL培养基中
7. 用培养皿盖盖好，于37 ˚C静置培养18–24小时。
8. 肉眼观察平板，最低浓度孔中无可见生长者即为最小抑菌浓度（MIC）。
   注意： 参见 表1 有关活性与非活性荧光抗生素的一些示例。

2. 通过分光光度法分析探针的累积

注意：这些离心时间已针对大肠杆菌（E. coli）进行优化，因此其他物种可能需要稍作调整。探针累积的代表性数据基于NBD标记的环丙沙星探针。

1. 将菌种的甘油保藏液划线接种于LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
2. 从平板上挑取单个菌落，在LB培养基中37 °C过夜培养。
3. 将过夜培养物在培养基中稀释约50倍，培养至对数中期（OD₆₀₀ = 0.4–0.8).
4. 将培养物在 1,470 x g 孵育25分钟，然后倾去培养基。
5. 将细菌重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后以 1,470 x g 离心 g 15 分钟。
6. 弃去上清液，将洗涤后的沉淀物重悬于 PBS 中，调整至终 OD₆₀₀ = 2.
7. 必要时，向1 mL细菌中加入10.1 μL羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP，10 mM溶于PBS中），使终浓度为100 μM，于37 ˚C孵育10分钟。
   注意： CCCP 是一种外排泵抑制剂。添加 CCCP 可用于检测外排作用的影响。
8. 将培养物在 18,000 x g 在20 °C下静置4分钟，然后倾去培养基。
9. 向沉淀中加入1 mL荧光标记的抗生素溶液（PBS中浓度为10–100 μM），37 °C孵育30分钟。
10. 将培养物在 18,000 x g 4 °C 下离心 7 分钟，倾去上清液。
11. 将细菌重悬于1 mL冷PBS中，并重复步骤2.9。
12. 重复步骤 2.10，共 4 次。
13. 如需要，可通过加入180 μL裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，2 mM EDTA钠盐）和70 μL溶菌酶（72 mg/mL，溶于H₂O）来裂解细菌₂O)
14. 37°C孵育30分钟，然后进行3次冻融循环（-78°C冷冻5分钟，再34°C融化15分钟）。
15. 将样品超声处理20分钟，然后在65 °C下加热30分钟。
16. 离心裂解后的样品（18,000 x g，8 分钟），然后通过 10 kDa 滤膜过滤。
17. 用100 μL水洗涤滤膜4次。
18. 将裂解液转移至平底黑色96孔板中，使用适合该荧光染料的激发和发射波长（例如，7-(二甲氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基 [DMACA]：λ）在酶标仪上测定荧光强度_ex = 400 nm，λ_em = 490 nm；硝基苯并二唑（nitrobenzoxadiazole，NBD）：λ_ex = 475 nm，λ_em = 545 nm
    注意： 参见 图1 以荧光NBD标记的环丙沙星抗生素对细菌进行分光光度分析的示例。

结果

表1. 基于环丙沙星、甲氧苄啶和利奈唑胺的荧光抗生素探针对相应临床相关细菌菌株的抗生素活性，通过肉汤微量稀释法 MIC 测定进行评估。在大多数情况下，这些探针相较于母体药物失去了一部分活性，但仍保留了可测量的抗生素效力（足以用于后续研究）。

		最低抑菌浓度（MIC，µg/mL）
物种	菌株	环丙沙星（Cipro）	Cipro-NBD	Cipro-DMACA

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元，Ultracel-10 膜	Merck	UFC501096
Bruker Avance 600 MHz 核磁共振波谱仪	Bruker
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Celite 545	Sigma-Aldrich	22140-5KG-F
Cygel	ABCAM	Ab109204
FM4-64FX，FM™ 4-64 膜染料的可固定类似物	Life Technologies Australia Pt	F34653
Gamma 2-16 LSCplus 冷冻干燥机	CHRIST
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 离心机	Hettich
LB 培养基	AMRESCO	J106
溶菌酶（来自鸡蛋清） 冻干粉末	Sigma-Aldrich	L6876
Mueller Hinton II 肉汤（阳离子调节）	Becton Dickinson	212322
Sigma 1-15 微型离心机	Sigma-Aldrich
TECAN Infinite M1000 PRO 多功能酶标仪	TECAN