结核分枝杆菌的抗菌药物敏感性试验具有挑战性，但对患者护理至关重要。这种微量滴定板格式可检测12种抗分枝杆菌药物，并提供最小抑制浓度（MIC）值，有助于制定恰当的治疗方案。
本文内容
摘要
摘要
快速检测抗微生物药物耐药性对于控制耐药结核分枝杆菌（Mtb）的传播至关重要。结核分枝杆菌的抗微生物药物敏感性试验（AST）传统上采用琼脂比例法或使用如BACTEC（Becton Dickinson，Sparks，MD）、VersaTREK（TREK Diagnostics，Cleveland，OH）或BacT/ALERT（bioMérieux，Hazelwood，MO）等仪器进行大剂量肉汤法检测。琼脂比例法虽被视为AST的“金标准”，但操作繁琐，需通过计数含药琼脂与无药琼脂上的菌落来计算耐药性。若在含药培养基上的生长量相对于无药培养基达到或超过1%，则判定该菌株对该药物耐药。大剂量肉汤法需要专用仪器，并针对一线药物（异烟肼、乙胺丁醇、利福平和吡嗪酰胺）测试其断点（“临界”）药物浓度。本文所述方法以96孔微量滴定板形式商业化提供[MYCOTB（TREK Diagnostics）]，其中包含12种用于结核病治疗的抗微生物药物的递增浓度，涵盖一线药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇）和二线药物（阿米卡星、环丝氨酸、乙硫异烟胺、卡那霉素、莫西沙星、氧氟沙星、对氨基水杨酸、利福布汀和链霉素）。由于吡嗪酰胺作为一线药物需在酸性条件下检测，因此未包含在该微量滴定板中。微量滴定系统的优点包括操作简便以及相比传统琼脂比例法更短的检测周期（14天 vs 21天）。此外，该板可使用液体或固体培养基制备的接种物进行接种。由于微量滴定板格式较新，且结核分枝杆菌在实验室中具有独特的生物安全挑战，本方案将详细说明如何安全地进行微量滴定板的制备、孵育和结果判读。
方案
每个实验室都需要与机构生物安全官员合作进行风险评估，以确定制备接种物以及将接种物加样到培养板时所需采取的适当生物安全等级。在本实验室中，从接种物制备至将接种物加入培养板并用塑料压敏封膜密封的整个过程，均采用生物安全三级实验室（BSL3）的操作规范。随后将这些培养板放入塑料袋中，并进行热封。微孔板的孵育及结果判读则在生物安全二级实验室（BSL2）中进行。
1. 材料标记
- 在生物安全二级实验室（BSL2）中，使用适当的标识（例如患者姓名、病历号）标记一个血琼脂平板、三个Middlebrook 7H10平板、Middlebrook 7H9液体培养基、一支含玻璃珠的吐温生理盐水管以及一个微量肉汤稀释药敏试验（AST）板。
- 将血琼脂平板和7H10平板标记为“纯度检查”。建议定期对接种物进行菌落计数，以确保试验中使用了适当浓度的微生物。若进行菌落计数，需将其中两个7H10平板分别标记为“1/1菌落计数”和“1/50菌落计数”。
2. 技术人员进入生物安全三级实验室前的准备工作
- 在生物安全三级实验室（BSL3）中工作必须穿戴适当的个人防护装备，包括前封式实验服、头罩、手套、鞋套和呼吸器。各机构应与本单位的工业卫生官员合作，制定各自的呼吸防护计划。在我们的实验室中，配备有多种呼吸器，包括动力送风过滤式呼吸器（PAPRs）以及配有HEPA滤芯的密合型N95半面呼吸器。
3. 生物安全柜的准备
- 在BSL3实验室中，通过消毒生物安全柜（BSC）表面，并在距通风面板约6英寸处放置一张浸有消毒剂的纸巾，以准备操作区域。
- 将废液容器放在左侧，小型比浊计和涡旋振荡器放在右侧。
- 接种环、移液器及吸头放置在纸巾旁边。
- 将装有菌种（液体培养物或固体培养基）的试管架与0.5麦氏标准比浊管一同放在纸巾上。
4. 浊度计的校准
- 将生理盐水吐温玻璃珠管放入浊度计中，并使用生理盐水吐温空白样将仪器调零。
- 将麦氏0.5标准管放入浊度计中，根据制造商说明书进行校准。
5. 接种物的制备
- 在生物安全柜中操作，使用无菌接种环将固体培养基上的菌落刮入已正确标记的含吐温-盐溶液玻璃珠试管中，直至菌悬液浊度达到或超过0.5麦氏比浊标准。
- 目视检查样本，并与麦氏比浊标准进行比较。
- 将样本涡旋振荡30至60秒。
- 静置接种液15分钟（设置计时器）。
6. 微孔板接种
- 在步骤4.1和4.2中，使用经比浊计校准至0.5麦氏单位的生理盐水吐温肉汤调整接种物。此操作必须在30分钟内完成（依据制造商说明书）。
- 使用 a 200 μL 移液器和长型抗气溶胶移液吸头以移除 100 μL 接种物取自上层1/3rd 生理盐水珠 Tween 管中。接种 Middlebrook 7H9 肉汤。将接种后的 7H9 肉汤缓慢涡旋振荡 20 秒。
- 从制造商包装中取出AST微量滴定板。如果干燥剂呈蓝色或铝箔包装破损，请勿使用。
- 移液制备1:50稀释液的稀释管，以备后续使用 50 μL 将无菌水加入无菌试管中。
- 小心将7H9肉汤接种物倒入槽中。避免产生气溶胶。
- 将AST微量滴定板放置，使标签朝向您。
- 使用12通道移液器加入 100 μL 将接种物加入每孔。
- 准备菌落计数用的稀释液：
- 1/1 稀释液通过从阳性对照孔（H12）划线制备 1 μl 7H10 平板上标记为“1/1”的环状区域
- 1/50 稀释液通过接种制备 1 μl 从阳性对照孔（H12）中取出环状物，并将其旋转加入到试管中 50 μl 上述制备的水试管中的划线 1 μL 将此稀释液加入标记为“1/50”的培养皿中。
- 用移液器从槽中接种纯度平板 50 μL 接种于适当标记的血琼脂和7H10平板上，划线分离。
- 在AST微量滴定板上贴上粘性封膜。使用封膜的白色背面，用力按压每个孔，确保密封充分，避免产生褶皱。
- 用含有结核杀菌消毒剂的纸巾擦拭微孔板进行消毒，并将微孔板放入塑料袋中，使用热封或胶带密封。
- 塑料袋作为第二层容器，可确保在初级培养皿发生泄漏或洒出时，所有培养液均被容纳其中。
7. 材料和生物安全柜的消毒
- 为避免产生气溶胶，在将已接种的槽放入废弃容器前，应先将另一个槽盖在已接种的槽上，并轻柔操作。
- 所有材料（包括比浊计、涡旋振荡器、培养皿、试管等）均需用杀结核消毒剂擦拭消毒，并根据制造商说明等待足够的作用时间，以确保有效消毒后方可移出生物安全柜。例如，我们使用的杀结核消毒剂Prospray需作用15分钟才能杀灭分枝杆菌。
- 将废弃容器放入生物危害袋中并密封，然后进行高压灭菌。
8. 培育
- 培养板应倒置培养，避免液体溢出或飞溅。
- 将AST微量滴定板、7H10平板和血琼脂平板置于35–37°C 5-10% CO₂ 培养箱2 含5-10% CO2 在BSL2实验室中。
- 在我们的实验室中，这是可接受的，因为培养板密封良好，并置于密封的塑料袋内。
- 根据制造商说明，孵育箱中堆叠的微量肉汤稀释药敏试验板不得超过2块。
9. 代表性结果
结果解读：
可使用镜面辅助人工读取密封的AST微量滴定板，或使用Vizion（TREK Diagnostics）等自动化酶标仪进行读取。接种后第7天即可开始检查平板。检查位于H11和H12位置的生长对照孔，判断其是否为阳性（即孔底部有细胞沉淀）。若生长对照孔未显示阳性，则需将平板重新放回培养箱继续孵育，并定期（例如第10天、第14天）重新检查，直至生长对照孔呈现阳性为止。
- 镜像读取：
- 将密封的AST微量滴定板放置于平台上；
- 孵育7天后读取生长对照孔；若结果为阴性，则重新孵育AST微量滴定板；
- 若生长对照结果符合预期，则读取含药孔。针对每种药物，通过将药物孔与生长对照孔进行比较，记录首个无菌生长的稀释度。
- 生长表现为浊度或孔底出现细胞沉积物。
- 仪器读取：遵循仪器制造商的操作说明；以下步骤以Vizion平台为例说明如何进行读取：
- 登录系统。
- 使用“MYCOTB” AST板专用软件。
- 将密封的微孔板放置于仪器上，条形码朝向操作者。生长表现为浊度或孔底出现细胞沉积物。
- 读取生长对照孔；若结果为阴性，则重新孵育AST微量滴定板；若为阳性，则通过触摸屏幕选择每种药物中首个未见生长的孔进行读取。
观察纯度平板。血琼脂平板在48小时后应无任何生长，而7H10纯度平板应显示单一微生物类型的融合性生长。若存在污染，需从纯培养物重新进行药敏微孔板试验。
使用下表计算阳性对照孔的菌落数量：
菌落计数关键
| 标记为“1/1”的平板上计数的菌落数 | 标记为“1/50”的平板上计数的菌落数 | 接种物菌落计数（cfu/mL） |
| <50 | 0 | <5 X 104 |
| 50-100 | 0-2 | 5 X 104 至 1 X 105 |
| >100 | ≤ 10 | 1 X 105 至 5 X 105 |
| >100 | >10 | >5 X 105 |
某些菌株中可能对对氨基水杨酸产生拖尾现象 Mycobacterium tuberculosis可通过观察所有含有沉淀物的孔，将与下一稀释度产生相同大小沉淀物的第一个孔作为终点进行判读。该药物的耐药性较为罕见。
图1. 使用MYCOTB板获得的代表性结果。
| 药物缩写 | 药物 | MIC μ/mL |
| OFL | ofloxacin | 16 |
| MXF | moxifloxacin | 8 |
| RIF | rifampin | >16 |
| AMI | amikacin | 0.5 |
| STR | streptomycin | 16 |
| RFB | rifabutin | 8 |
| PAS | p-aminosalicylic acid | ≤0.5 |
| ETH | ethionamide | 5 |
| CYC | cycloserine | 4 |
| INH | isoniazid | 2 |
| KAN | kanamycin | 1.2 |
| EMB | ethambutol | 4.0 |
讨论
图1展示了一个包含阳性生长对照的AST微量滴定板示例，每种药物的终点MIC（μg/ml）已用圆圈标出。我们实验室开展的一项研究表明，AST微量滴定板法在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）药物敏感性检测方面与金标准——琼脂比例法具有等效性。与传统的琼脂比例法相比，使用微量滴定板进行AST可更快地报告结果，AST微量滴定板法和琼脂比例法的最终判读时间分别为14天和21天。AST微量滴定板的优势在于可同时检测一线和二线药物，有助于避免对耐药菌株产生过度延误。此外，AST微量滴定板比琼脂比例法更易于操作和判读，既可使用手动镜面读板，也可采用VIZION等半自动化系统进行判读。相较于传统的临界浓度值，获得结核病药物耐药检测的MIC值可为临床医生提供更有价值的新信息，尤其对于那些“临界”敏感的菌株。
致谢
我们感谢梅奥诊所分枝杆菌实验室的实验室技术人员在研究期间提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AST 微量滴定板和粘性封膜 | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 标准比浊管 | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 培养板 | Fisher Scientific | ||
| 血琼脂培养板 | Fisher Scientific | ||
| 无菌接种环，1 μL | Fisher Scientific | ||
| 无菌接种环，10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween 玻璃珠肉汤 | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC 肉汤 | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| 长吸头 | Fisher Scientific | ||
| 无菌加样槽 | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| 移液器：1000、200、20 μL | Fisher Scientific | ||
| 吸头：1000、200、20 μL | Fisher Scientific | ||
| 多通道移液器 | Fisher Scientific | ||
| 培养箱，5–10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| 小型塑料袋，可透过 CO2 | Poly Plastic Products | ||
| 结核菌消毒剂（如 ProSpray C-60） | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| 镜面箱读数仪 | Fisher Scientific |
参考文献
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