评估粪菌移植在白细胞介素-10缺陷小鼠中的作用

摘要

来源：Xiao, Y. 等，白细胞介素10缺陷小鼠模型中粪菌移植的治疗效果评估 J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了在结肠炎的白细胞介素-10缺陷小鼠中进行粪便微生物移植的操作过程。肠道内定植的粪便微生物会释放次级代谢产物，诱导抗炎性细胞因子的释放，从而减轻结肠炎症。

方案

所有涉及动物模型的实验步骤均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 新鲜粪便样本的采集

1. 准备无菌纸巾、钝头镊子和 50 mL 离心管。
   1. 将部分纸巾和镊子分别放入独立的灭菌袋中，并在干热条件下于 180 °C 灭菌 30 分钟。同时使用无菌的离心管。称量离心管并将其重量标记在管壁上。
2. 打开动物房内的生物安全柜。
3. 取一个已灭菌且不含垫料的清洁小鼠笼，放入生物安全柜中。取下笼盖和食槽，并将其一并置于柜内。
4. 在笼底放置一些无菌纸巾，并将金属架重新放回笼子上方。
5. 选择年龄匹配的粪便供体小鼠，将小鼠笼放入生物安全柜中。打开笼子，用镊子轻轻抓住供体小鼠（C57BL/6J）的尾巴，将其放置在清洁笼子上方的金属架上。
6. 将笼盖盖在金属架上方，等待小鼠排便。
   注意：可同时将几只同窝小鼠放在金属架上。
7. 收集粪便颗粒，并将其放入无菌的 50 mL 离心管中。按性别分别收集粪便颗粒，不得混合来自雄性和雌性小鼠的粪便颗粒。
8. 再次称量离心管，计算粪便颗粒的重量。

2. 粪便悬液的制备

1. 制备无菌溶液（10% 甘油生理盐水）。
2. 每克粪便颗粒加入 10 mL 的 10% 甘油/生理盐水至锥形管中。
   注意：如有需要，可将溶液体积增加至 20 mL。本研究中也采用每粒粪便颗粒（5–10 mg）加入 1 mL 溶液。
3. 在生物安全柜内使用台式匀浆器或搅拌器以低速匀浆混合物，使粪便充分重悬（3 次，每次 30 秒）。
4. 将粪便悬液通过两层无菌棉纱布（10.2 cm × 10.2 cm）过滤。滤液可暂时储存于冰箱中，最长不超过 6 小时；或分装至无菌冻存管中，保存于 -80 °C 超低温冰箱。
5. 按照标准操作程序彻底清洗匀浆器或搅拌器。

3. 通过口服灌胃给予粪便悬液

1. 若使用冷冻样本，需将冷冻的粪便悬液置于冰上解冻。解冻后通过涡旋振荡充分混匀粪便悬液。
2. 将新鲜或已解冻的粪便悬液转移至1 mL注射器中。
   注意：每只小鼠将接受总共200 µL的粪便悬液；对照组中的每只IL-10^-/- 小鼠将接受200 µL的10%甘油/生理盐水。
3. 称量小鼠体重，并选择合适的灌胃针规格及最大给药体积。
   注意：对于体重在20–25克之间的小鼠，应使用20 G、3.81 cm长的弯头灌胃针，末端带直径2.25 mm的球头。更多详细信息请访问gavageneedle.com。
4. 通过测量小鼠鼻尖至剑突（胸骨下端）的距离来测试灌胃针长度。用10%甘油/生理盐水或粪便悬液填充注射器，并排除注射器及针头内的气泡。
   注意：若针头长度超过该距离，应在针杆或导管上对应鼻尖位置处做一标记。操作时切勿将针头或导管插入超过该标记，以防胃穿孔。
5. 将一个鼠笼放入生物安全柜中，取下塑料笼盖，保留金属笼架。
6. 抓住小鼠尾巴将其放置于金属笼架上。一手握住尾巴，另一只手用拇指和中指捏住肩部皮肤以固定动物，使前肢向两侧伸展，防止前爪将针头推出。轻柔地向后伸展动物头部，并用手固定头部位置。
   注意：实验人员应在熟练掌握小鼠操作技术并具备充分信心后，再开始正式实验。
7. 将灌胃针置于舌面上方进入口腔内，沿上颚轻柔推进，直至针头到达食管。应平稳地一次性完成插入动作。如遇阻力，切勿强行推进，应退出针头后重新尝试。
8. 确认针头正确就位后，缓慢推动连接的注射器，以注入样品。切勿旋转针头或继续向前推进，以免导致食管破裂。给药完成后，轻柔地将针头拔出。
9. 将小鼠放回原笼。观察动物5–10分钟，注意是否有呼吸困难或不适表现。在粪便微生物移植（FMT）后12–24小时内再次进行监测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD 注射器，1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
钝头镊子	Knipex	926443
C57BL/6J 小鼠	Jackson Lab	664
离心机	Eppendorf	5415R
锥形管	ThermoFisher	339650
弯曲喂食针头	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
甘油	MilliporeSigma	G5516
IL-10 基因敲除小鼠	Jackson Lab	4366
USP 生理盐水	Grainger	6280
麻醉气体挥发器	Euthanex Corp.	EZ-108SA