一种培养小鼠海马神经元的技术

摘要

来源：Yang, R.，等。利用原代培养的海马神经元研究轴突起始段的组装。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了一种从小鼠海马体中培养神经元的方法。首先，对海马体进行酶消化以降解细胞外基质。随后，通过机械方法将消化后的组织分散，以分离单个神经元。最后，将这些神经元接种在胶质饲养细胞上进行培养。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备胶质细胞饲养层培养皿（培养日前两周）

1. 从出生后1天的小鼠脑中解剖出皮层，并剥离脑膜。
2. 在洁净的超净台中，使用干净的剪刀将皮层组织尽可能剪碎，置于干净的培养皿内。
3. 将剪碎的组织转移至12 mL HBSS中，加入1.5 mL 2.5%胰蛋白酶和1% (wt/vol) DNase。在37 °C水浴中孵育15分钟，每5分钟轻轻摇动一次。消化充分的组织会变得黏稠并形成大团块。用10 mL移液管吹打10–15次，以破碎组织，促进更充分的消化。
4. 用5 mL移液管将消化充分的组织吹打10–15次，直至大部分组织块消失，液体变浑浊。通过细胞筛网过滤，去除残留组织块，并加入15 mL胶质细胞培养基（含葡萄糖（0.6% wt/vol）、10% (vol/vol) 马血清和青霉素-链霉素（1x）的最低必需培养基（MEM）），以终止消化反应。
5. 以120 × g离心5分钟，吸除上清液。用新鲜胶质细胞培养基重悬细胞沉淀，并接种于细胞培养皿中（约10⁵ 个细胞/cm²）。
6. 次日更换为新鲜胶质细胞培养基，以去除未贴壁的细胞。
7. 每3–4天用新鲜胶质细胞培养基更换培养液。换液前用手轻轻拍打培养瓶5–10次，以去除松散贴壁的细胞。
8. 培养10天后，胶质细胞应接近完全汇合。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，将约10⁵ 个细胞接种至新的60 mm细胞培养皿中。剩余细胞可冻存以备后续使用。
9. 在神经元接种前3天，将胶质细胞培养基更换为神经元培养基（Neurobasal-A培养基，添加1x GlutaMAX-I和1x B27补充剂）。

2. 培养海马神经元

注意：所有步骤均在室温下进行。

1. 在室温下，用 HBSS 培养基从出生后1天的 ANK3-E22/23f/f 小鼠幼崽中解剖出6-8个海马体，并在培养皿中用解剖剪将海马体剪成更小的组织块。将海马体从培养皿转移至15 mL离心管中。
2. 在离心管中用5 mL HBSS洗涤海马体两次。洗涤后，将海马体保留在4.5 mL 1×HBSS中。
3. 向4.5 mL HBSS中加入0.5 mL 2.5%胰蛋白酶，于37 °C水浴中孵育15分钟。每5分钟轻轻颠倒混匀一次。充分消化的海马体应变得黏稠并聚集成团。如有需要，可延长消化时间5分钟。
4. 用 HBSS 洗涤海马体三次，每次5分钟。不要使用真空泵去除 HBSS，以免将海马体组织吸走。
5. 洗涤后加入2 mL HBSS，用巴斯德移液管上下吹打海马体组织15次。
6. 使用火焰抛光的巴斯德移液管（管口直径缩小约一半）吹打组织10次。即使仍有组织块残留，也不应超过10次，过度剪切会杀死神经元。
7. 将离心管静置5分钟，待所有组织块沉降至管底。用1 mL移液枪小心吸取上清液（含解离的神经元），转移至铺板培养皿中（每60 mm培养皿接种10⁵个细胞）。直接将细胞悬液加入预温的铺板培养基中，并轻轻摇晃培养皿。
8. 对剩余的组织块重复步骤2.6–2.7，直至大部分组织块消失。
9. 接种后2–4小时，用光学显微镜检查培养皿。大多数神经元应已贴附于盖玻片上。贴壁细胞呈圆形且透亮。使用精细镊子将盖玻片翻转，转移至含有预处理神经元培养基的胶质细胞饲养层培养皿中，确保蜡点面朝下。
10. 神经元可在胶质细胞饲养层培养皿中生长长达1个月。每隔7天添加1 mL新鲜神经元培养基进行换液。
11. 可选步骤：接种1周后，加入阿糖胞苷（1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶），终浓度为5 μM，以抑制胶质细胞增殖。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18 mm 盖玻片（1.5D）	Fisher Scientific	12-545-84-1D
不含酚红的 2.5% 胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	14065-056
ANK3-E22/23f/f 小鼠	JAX	货号：029797
盐酸多聚赖氨酸	Sigma-Aldrich	26124-78-7
B27 无血清添加剂	Thermo Fisher Scientific	A3582801
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I 添加剂	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
含 Earle's 盐和 L-谷氨酰胺的 MEM	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	21103-049
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122