从冻存的胚胎神经元制备低密度原代神经元培养物

摘要

来源：Koganezawa, N. 等，利用冻存胚胎海马神经元进行简便且可重复的低密度原代培养 J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了冻存胚胎神经元的培养方法，包括控制性解冻、用神经基础培养基稀释，并接种至多聚-L-赖氨酸包被的培养板上。随后的孵育过程有助于神经元连接的生长与维持。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 包被平板

1. 用多聚-L-赖氨酸（1 mg/mL，溶于 0.1 M 硼酸盐缓冲液 [pH: 8.5]；每孔 100 µL）包被 96 孔微孔板，37 °C 下孵育过夜。
   注意：仅包被需要使用的孔。本实验中使用中间的 60 个孔。硼酸盐缓冲液通过将 50 mM 硼酸和 12 mM 硼酸盐溶于无菌水配制而成。
2. 用无菌水洗涤微孔板两次（每孔 250 µL）。
3. 用不含添加剂的新鲜培养基洗涤微孔板一次（每孔 250 µL）。
4. 在洁净台中干燥微孔板 20 分钟。
5. 用铝箔纸包裹微孔板，4 °C 保存备用（有效期为 1 个月）。

2. 细胞接种

1. 向包被好的孔板中每孔加入 50 µL 培养基，置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时。将周边孔中加入无菌水（每孔 200 µL）。 
   注意：培养基的配制方法是将 50 倍浓度的 B-27、400 倍浓度的 Glutamax 以及 100 U/mL 青霉素/链霉素加入神经基础培养基（Neurobasal medium）中（详见 材料表 ）。
2. 从液氮罐中取出神经元冻存管。此处使用的神经元为二甲基亚砜冷冻保存（DMSO-cryopreserved）的神经元。
3. 将冻存管浸入 37 °C 金属浴中最多 3 分钟，使其内容物部分解冻。避免过度加热冻存管。一旦解冻，立即转移至 50 mL 离心管中。
4. 使用带宽孔枪头的 1 mL 移液器，以滴加方式（50 µL/s）缓慢将冻存管中的内容物逐滴转移至无菌 50 mL 离心管中。
5. 用 1 mL 培养基（室温；RT）冲洗空冻存管，并将此 1 mL 培养基以滴加方式（50 µL/s）逐滴加入含有细胞悬液的 50 mL 离心管中。
6. 向 50 mL 离心管中逐滴加入 9 mL 培养基（RT）（0.5 mL/s），最终体积为 11 mL。不要反复吹打，应缓慢混匀细胞悬液。
7. 计数细胞数量（可使用细胞计数仪或血细胞计数板）。
8. 将全部细胞悬液转移至储液槽中，使用带宽孔枪头的多通道移液器将细胞悬液分配至 96 孔板（每孔 1.0 × 10⁴ 个细胞）。为减少培养基蒸发，向周边孔中加入无菌水（步骤 2.1）。
   注意：本研究证实，在为期 3 周且不更换培养基的培养过程中，培养基蒸发量较小。培养基体积减少率为 3.6%（n = 120 孔）。因此，在 3 周的培养期间，渗透压变化不会显著。
9. 将神经元置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1–2 小时。
10.  每孔更换为 100 µL 预热的培养基（37 °C），然后放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中（培养期间无需更换培养基）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Zeon Corporation		天赋异禀
96孔板	greiner	655986
B-27	Gibco	17504-044	MEA 平板为 2 体积百分比；普通平板为 50 倍
硼砂	Sigma	B-9876	终浓度 12 mM
硼酸	WAKO	021-02195	终浓度 50 mM
牛血清白蛋白	Millipore	12659-100G	终浓度：PBS 中 3%
GlutaMAX	Gibco	35050-061	2.5 mM 用于 MEA 平板；400 倍稀释用于普通平板
In Cell Analyzer 2200	Cytiva		荧光图像
Neurobasal	Gibco	21103-049
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122	100 U/mL，用于普通培养板
青霉素/链霉素	nacalai tesque	26253-84	MEA 平板中 100 µg/mL
聚-L-赖氨酸	Sigma	P2636	用硼酸盐缓冲液稀释（终浓度：1 mg/mL）
SKY 神经元	AlzMed , Inc.	ARH001	1.0 × 10⁶ 细胞/管